בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה שבה משתמשים ניתן לתחזק הכדאיות של ההכנות חריפה פרוסה בהיפוקמפוס, בקליפת המוח במהלך איסוף של נתונים מיקרוסקופ תהודה מגנטית.
פרוטוקול זה מתאר את ההליכים הנחוצים כדי לתמוך פונקציות מטבוליות נורמלית של המוח חריפה פרוסה ההכנות במהלך איסוף של נתונים מיקרוסקופ תהודה מגנטית (MR). אמנם זה ניתן לבצע מר אוספים על רקמות בתרבית של חי, נכרת, ניסויים אלה באופן מסורתי יש היה מוגבל בשל מגבלות רזולוציה, ולכן אינם מסוגלים להמחיש רקמות מיקרו. לעומת זאת, פרוטוקולים של מר להשיג רזולוציה של תמונה מיקרוסקופית נדרש שימוש קבוע דוגמאות כדי להתאים את הצורך תנאים סטטיים, משתנה על פי הסריקה ממושך. בפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטה מר זמין הראשונה המאפשרת הדמיה של דגימות רקמה חי, יונקים ברזולוציות מיקרוסקופיים. נתונים מסוג זה הוא בעל חשיבות רבה להבנת איך מבוסס על פתולוגיה ניגודיות שינויים המתרחשים ההשפעה ברמה מיקרוסקופית התוכן של סריקות מר מאקרוסקופית כגון אלה להשתמש במרפאה. פעם אחת כזו הבנה זה יתממש, שיטות אבחון עם יותר רגישות ודיוק יכול להיות מפותח, אשר יתרגם טיפול מוקדם יותר של המחלה, מעקב אחר טיפול מדויק יותר של תוצאות משופרות.
בעוד המתודולוגיה המתוארת מתמקד המוח פרוסה ההכנות, הפרוטוקול לסגלה כל פרוסה רקמת נכרת לאור העובדה שינויים ההכנות והגז perfusate כדי להתאים לצרכים מטבוליים הספציפיים של הרקמה. ביצוע מוצלח של הפרוטוקול צריך לגרום ההכנות פרוסה חי, חריפה, כי התערוכה מר דיפוזיה אות יציבות לתקופות 15.5 h. היתרונות העיקריים של המערכת הנוכחית מעל אחרים שההדרכה זלוף תואם מר הם התאימות שלו עם מר מיקרוסקופ החומרה הדרושה כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה יותר ויכולת לספק זרימה קבועה, ללא הפרעה עם בזהירות תנאים perfusate מוסדרים. תפוקת מדגם מופחת הוא שיקול עם העיצוב הזה כמו פרוסה אחת בלבד רקמות עשויה לדימות בכל פעם.
כמו מערכות תהודה מגנטית (MRI) התקדמו בהתמדה כדי שדה גבוהה פעם החוזק, פרטים נוספים על הרכב ואת המצב של רקמות החי הפכו ניכרת. למרות ההתקדמות חומרה כזו, מר הדמיה ברזולוציות מספיק כדי להמחיש את המבנים התאיים של רקמות היא עדיין אינה זמינה במרפאה. כתוצאה מכך, מאפייני הסלולר ברמת רקמות חייב מהמשמעת כאשר בוחנים את התוכן של סריקות קליניים. היסק כזה דורש ידע של תהליכים המקביל שלוקט נתונים על מערכות מודל אשר יכול להיות שנצפו ישירות. באופן מסורתי, מודלים אלה כללו תאים של אורגניזמים ימיים כגון צפרדע רפואית זריזה oocyte ו Aplysia קליפורניה L7 נוירון1,2. אלה היו בין תאי בעלי חיים הראשון זמין עבור תצפית עם מר שיטות עקב גודלם אופיינית גדולה: כ 1000 μm ואת קוטר 300 μm, בהתאמה. לאחרונה, התקדמות בעיצוב החומרה אפשרו לאחת הדוגמאות הגדול של תאי יונקים — α-מוטור נוירון — לדימות באמצעות טכניקות במיקרוסקופ מר על רקמות קבוע3,4. בעוד מחקרים אלו הראו פריט חזותי ישיר של יונקים חומר הסלולר באמצעות מר, הדגימות קבועים המועסקים נבדלים באופן משמעותי תכונותיהם מר מרקמות בשידור חי, ולכן לא יכולה לשמש מודל נציג שווי ערך5, 6. חשוב יותר, התבוננות מר ניגודיות שינויים המתרחשים בתאום עם תהליכים ביולוגיים מורכבים דורשת דגימות חיים זה יכול להיות מוטרד שנמדד במהלך הניסוי הדמיה.
כדי להקל על מר מחקרים מיקרוסקופ על רקמות החי, מוצג פרוטוקול הכולל חומרה microimaging מסחרי7 לממשק בנוי למטרה, מר תואם, ב נשא oxygenator של המכשיר זלוף שתואר קודם לכן8 . היתרונות הייחודיים של עיצוב זה לכלול הסלולר ברמת רזולוציה יכולות בתרבית של רקמות, דיוק שליטה על גזים מומסים תוכן ו- pH באתר של רקמות זלוף. כמו כן, בניגוד לרוב לימודים מר explant להפריע זלוף במהלך ייבוא תמונות כדי למנוע זרימה חפצי אמנות, עיצוב זה תומך בשימוש זלוף רציפה במהלך איסוף נתונים אשר הוכח לשפר את מצבם פיזיולוגיים של מבודדים רקמות9,10. לבסוף, שלה סגור הקלטה קאמרית ושמירה פרוסה חומרה סיוע בהקטנת הסבירות בחפצים תנועה אחרת יכול להתרחש במהלך ממושכת אוסף תמונה.
בעוד בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליכים המתאים לשימוש עם פרוסות בהיפוקמפוס ואת קורטיקלית חריפה, שליטה מדויקת perfusate מטבוליטים מאפשר מערכת זו להתאים מגוון רחב של סוגי רקמות מגוונות ותנאי ניסיוני. מגבלות של עיצוב זה כוללות הפחתה מדגם התפוקה לעומת קאמרית פרוסה רב זלוף11; עם זאת, מגבלה זו עשויה להתגבר בעתיד השימוש במערכים רב סליל.
בעוד המערכת המתוארת יוכל להיות מועסק בתצורות אופקי או אנכי, בפרוטוקול הנוכחי כולל גם השימוש בו שכיוונו אנכי, ספקטרומטר 600 מגה-הרץ. כל מערכת מסוגל מר microimaging מחקרים — בדרך כלל צר נשא (≤6 ס מ), שדה גבוה (≥500 MHz) ספקטרומטרים — יהיה להתאים את הציוד oxygenator זלוף המתואר. עם זאת, שינויים הסליל הדמיה, מעבר צבע, מערכת בדיקה או חומרה הדמיה חיוניים אחרים המועסקים עשויים להצריך שינויים ל מר סריקה פרמטרים וציוד זלוף.
בפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההליכים הדרושים לתחזוקה מטבולית סטנדרטי של המוח חריפה פרוסה ההכנות שעברו מיקרוסקופ תהודה מגנטית. ההליך זה השיטה היחידה זמין כעת המאפשר ויזואליזציה של רקמות בתרבית של החיים עם מר ברזולוציות מסוגל לפתור תאים. בעוד perfusate בתנאים המתוארים המותאמים במיוחד בשביל לרקמות מערכת העצבים המרכזית, הפרוטוקול לסגלה נרחב בכל צורה של חיים הכנה רקמות באמצעות התאמות של המרכיבים perfusate וגז, כמו גם קצב הזרימה זלוף הטמפרטורה.
הבעיות הנפוצות ביותר נוטים להיות נתקלה במהלך ההליכים המתוארים כוללים את אלה הקשורים כשלים באספקת מטבוליט. משקעים של מלחי סידן יכולה להתרחש בתוך חנה המבר במהלך אי ספיקה לגז בשל כשלים ביקרבונט אגירה מערכת. כל כך פוחת משקעים ניתן לסתום את הקווים זלוף, לגרום נזק חמור חומרה. אם פוחת משקעים מלח הם נצפו על perfusate בעקבות בדיקה הרכבה, הפסקת זרימת זלוף מיד על-ידי ביטול את משאבת סחרור. לאשר נוכחות מספקת רמות נתרן ביקרבונט (4.37 גרם של 2 L) perfusate, CO2 רמות (5.0%) אספקת גז, ואת זרימת הגז carbogen (L-1/16/דקה) לתוך מאגר והן oxygenator. לבסוף, אשר רמות ה-pH התייצבו בטווח פיזיולוגיים (7.3-7.4). בכל מקרה שבו רמות חמצן גז ו- pH עדיין לא מוסדר כראוי, יש להחליף את קרום חילופי גז.
אם פרוסות לא אות יציבות במהלך המיועד ניסיוני הזמן-, תערוכה לאשר כי המרכיבים הכימיים הנכונים נמצאים התערובת כלנית חדד, כי osmolality הנכון (300 mOsm) ו- pH (7.3-7.4) נשמרים. כמו כן, ודא carbogen הגז מסופק מאגר perfusate ו- oxygenator-L-1/16/min. אם שלבים אלה לא פותרות perfusate תנאים, החלפה של קרום חילופי גז מומלץ. אם הרקמה יציבות לא מושגת לאחר פתרון בעיות התנאים perfusate, שקול עידון של פרוטוקול כירורגית עם דגש על צמצום את מרווח הזמן בין יישום הקציר זלוף רקמות.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (1R21NS094061-01A1) (1R01EB012874 NIH-01) (S10RR031637), ואת הקרן הלאומית למדע (הסכם שיתופיות מס DMR-1157490) באמצעות מתקן דימות תהודה מגנטית מתקדמת לאומי גבוה שדה מגנטי מעבדה (NHMFL) ו ספקטרוסקופיה (AMRIS) UF, פלורידה.
Perfusate Preparation | |||
Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Slice Preparation | |||
Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusion System | |||
Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MR Imaging Hardware | |||
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |