Роговицы тканевая инженерия: В пробирке модель стромальные нерва взаимодействий человека роговицы
Summary
Этот протокол описывает Роман трехмерных в vitro модель, где роговицы стромальные клетки и дифференцированной нейрональные клетки культивировали вместе для оказания помощи в рассмотрении и понимания взаимодействия типов двух клеток.
Abstract
Тканевая инженерия получила значительное признание из-за высокого спроса на человека роговицы замены с примерно 10 миллионов человек во всем мире, страдающих от роговицы зрение потери1. Для удовлетворения спроса на жизнеспособного человека роговицы, значительный прогресс в трехмерной (3D) ткани инженерных сделал2,3,4. Эти роговицы модели варьируются от простых монослоя систем многослойных моделей, ведущих к 3D полный Толщина роговицы эквиваленты2.
Однако использование 3D инженерии тканей роговицы в контексте в vitro модели заболеванием учился дата отсутствует сходство структуры многослойного 3D ткани роговицы, функции и сетей различных типов клеток (то есть, нерв, эпителий, строма и эндотелием)2,3. Кроме того возрос спрос на в vitro модели ткани роговицы в попытке уменьшить животных испытаний фармацевтической продукции. Таким образом чтобы лучше соответствовать систем для физиологических потребностей человека требуются более сложные модели, и развитие модели, которая является более актуальной для популяции пациентов является абсолютно необходимым. Учитывая, что несколько типов клеток роговицы, пострадавших от заболеваний и дистрофии, как кератоконус, диабетическая Кератопатия и Фукс, эта модель включает в себя 3D Сопредседатель культуры модель первичной роговицы фибробластов (HCFs) от здоровых доноров и нейроны от SH-SY5Y линия клетки. Это позволяет нам в первый раз для изучения взаимодействия между типами две ячейки в пределах человеческой ткани роговицы. Мы считаем, что эта модель может потенциально вскрыть основные механизмы, связанные с взаимодействия стромальные нервных заболеваний роговицы, которые демонстрируют повреждения нерва. Эта 3D модель зеркала основных анатомических и физиологических характер ткани роговицы в естественных условиях и может использоваться в будущем как инструмент для расследования роговицы дефектов, а также проверки эффективности различных агентов до животных тестирования.
Introduction
В человеческом теле роговицы является наиболее плотно иннервируемые ткани. Нервы отвечают за различные ощущения, как прикосновение, боль, температура, а также играют важную роль в заживление ран, мерцание рефлексов, слезу производства и секреции5,6,7. В роговицы стромы нервных стволов возникают из послабляющие сплетения и радиально введите периферийных стромы роговицы. Стромальные нерв Организации параллельно с ламелями коллагена и они далее филиала в небольших брошюр, как они приступили к поверхностным стромы5,8. Нервных волокон далее проникать эпителиального пласта и таким образом, иннервация широко разбросаны по эпителия роговицы и стромы. Таким образом иннервации имеет важную роль в здоровых и больных состояние роговицы. В этом протоколе мы выявляем улучшения модели Роман 3D в пробирке , который является первым в своем роде для имитации взаимодействия стромальные нерва в естественных условиях . SH-SY5Y линия клетки была использована для этого исследования, как это один из самых известных, хорошо характеризуется линий, используемых для изучения нейрональных роста. SH-SY5Y клеточная линия была описана производить как сторонник субстрата (S-тип) и neuroblastic (N-тип) клетки, которые могут пройти transdifferentiation9. В результате даже несмотря на то, что эта линия клетки является производным от тройной последовательных subclone выбор N-типа клеток, он также содержит небольшое количество S-тип клеток, способных проходят дифференцировку в нейронах с помощью ретиноевой кислоты и мозга, полученных нейротрофических факторов9. Это представляет собой инструмент, который может привести к более глубокому пониманию роговицы осложнений, связанных с диабетической ретинопатии (DM) и других глазных заболеваний. Из-за трудностей, связанных с получением и культивирования нейроны от пациентов с глазной болезни эта модель 3D в vitro обеспечивает существенные последствия в изучении взаимодействия нейронов и сигнализации с стромы роговицы.
Часто больные условия влияют на различных тканях тела в очень больших масштабах, ведущих к угрозу качеству жизни. Глазной дистрофии являются общие осложнения часто ассоциируется с системными заболеваниями и привести к Потеря остроты или даже постоянного видения. Всеобъемлющие исследования часто необходимы для лучшего понимания состояния болезни, а также воздействие на клеточном уровне базальных. Для изучения последствий таких заболеваний, были разработаны различные модели в естественных условиях и в пробирке с помощью ткани, инженерных приложений. Ткани роговицы инженерных приложений имеют получил большой интерес в различных областях науки10,11,12,13,14, но есть еще крупные ограничения во время практического применения, включая роговицы графт отказов, инфекции и рубцов10,11,12,,1314. Есть несколько исследований, которые успешно разработаны и созданы различные в vitro модели3,,1516,17,18, 19,20,21,,2223,24,25,26. Модели 3D в vitro являются наиболее перспективных и большой научный интерес. 3D модели известны лучше зеркало в vivo сотовой и физиологических событий, которые являются критическими во время фиброз и ранение исцеления15,27,,28–29. Эти модели в vitro играют важную роль в поиске новых терапевтических подходов для лечения различных заболеваний включая роговицы осложнений. Несмотря на решающую роль иннервации роговицы функций был достигнут мало усилий для поощрения распространения периферических нервов в течение роговицы ткани инженерных конструкций2,3. Однако предлагаемые 3D в пробирке клеток конструкции имитировать ткани-мишени для достижения желаемого ткани функциональность.
В то время как диабетическая Кератопатия очевидное применение для модели, описанные здесь из-за дефектов нейронов, существует несколько других заболевания роговицы, которые могут принести пользу от человека в vitro модели, включая кератоконуса и Фукс дистрофии. Наши 3D модель выходит из этой перспективы и предлагает развитие представительства в vitro ткани роговицы оценить доставки лекарств и безопасность новой глазной лекарств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько исследований были сосредоточены на разработке различных животных моделей, которые могут помочь в разработке более глубокого понимания заболевания роговицы, а также обнаружить лечения. Однако важное значение для людей из этих исследований не была проверена. На сегодняшний д…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы выразить искреннюю признательность д-р Бен Фаулер за его техническую помощь ТЕА экспериментов.
Materials
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
Referenzen
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. -. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
- Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).
- Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications. BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).
- Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. Corneal nerves in health and disease. Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).
- Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties. Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Wang, S., et al. In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation. Biomaterials. 112, 1-9 (2017).
- Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells. J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).
- Griffith, L. G., Naughton, G. Tissue engineering – Current challenges and expanding opportunities. Science. 295 (5557), (2002).
- Guo, X., et al. Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).
- Karamichos, D. Ocular tissue engineering: current and future directions. J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).
- Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression. J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).
- Ruberti, J. W., Zieske, J. D. Prelude to corneal tissue engineering – gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).
- Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).
- Chen, F. M., Liu, X. Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering. Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).
- Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes. PLoS One. 11 (12), e0168845 (2016).
- Karamichos, D., Hjortdal, J. Keratoconus: tissue engineering and biomaterials. J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).
- Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).
- Proulx, S., et al. Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types. Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).
- Gonzalez-Andrades, M., et al. Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function. Sci Rep. 6, 19395 (2016).
- Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. 3D in vitro modeling of the central nervous system. Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).
- Schulz, S., et al. Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology. Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).
- Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).
- Koulikovska, M., et al. Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).
- Zieske, J. D. Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).
- Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).
- Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).
- Karamichos, D., et al. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).
