Segunda geração harmônica sinais na esclera coelho como uma ferramenta para avaliação do tecido terapêutico do cross-linking (TXL) para miopia

Summary

Este protocolo descreve técnicas para a avaliação química do cross-linking de esclera coelho usando a imagem latente de geração segundo harmônico e diferencial de calorimetria de varredura.

Abstract

Métodos para fortalecer o tecido com a introdução de ligações químicas (não enzimáticos do cross-linking) nas proteínas estruturais (colagénios fibrillar) para terapia incluem Cross-linking fotoquímicos e tecido do cross-linking métodos (TXL). Tais métodos para induzir alterações de propriedade mecânica do tecido estão sendo empregados para a córnea em afinamento corneano (mecanicamente enfraquecido) doenças como ceratocone, bem como a esclera em miopia progressiva, onde afinamento e enfraquecimento da posterior esclera ocorre e provavelmente contribui para o alongamento axial. As proteínas alvo primário para tal reforço de tecido são fibrillar colágenos, que constituem a grande maioria das proteínas de peso seco na córnea e esclera. Fortuitamente, fibrillar colágenos são a principal fonte de segunda geração harmônica sinais no espaço extracelular de tecido. Portanto, modificações das proteínas de colágeno, tais como aqueles induzida através do cross-linking terapias, potencialmente poderiam ser detectadas e quantificadas através da utilização de microscopia de segunda geração harmônica (SHGM). Acompanhamento SHGM sinaliza através do uso de um laser acoplado com uma luz infravermelha da excitação do sistema de microscopia de varredura fonte é um método de imagem moderno emocionante que está desfrutando de uma utilização generalizada em ciências biomédicas. Assim, o presente estudo foi realizado para avaliar o uso da microscopia SHGM, como um meio para medir induzida do cross-linking efeitos em ex vivo esclera de coelho, após uma injeção de uma substância química do cross-linking agente no espaço do subespiga (sT), uma injeção ou seja abordagem prática padrão para causando anestesia ocular durante os procedimentos de clínicos oftalmológicos. O produto químico agente do cross-linking, hidroximetilglicinato de sódio (SMG), é de uma classe de cosméticos conservantes conhecidos como formaldeído, liberando agentes (FARs). Scleral alterações após reação com SMG resultaram em aumentos no SHG sinais e correlacionadas com mudanças na temperatura de desnaturação térmica, um método padrão para avaliar induzido tecido efeitos do cross-linking.

Introduction

Miopia progressiva é postulada para ser tratável através de não enzimáticos scleral cross-linking (fotoquímicos e/ou química), que faz sentido, dado que o bloqueio do cross-linking enzimática colágeno pode aumentar a privação de forma experimental (FD)-induzido miopia,¹. ElSheikh e Phillips² recentemente discutido a viabilidade e o potencial do uso padrão irradiação ultravioleta-A (UVA)-riboflavina mediada fotoquímica do cross-linking (também conhecido como o protocolo de Dresden), abreviado aqui como (riboflavina CXL) para estabilização posterior scleral travar o alongamento axial na miopia. Esse método fotoquímico utilizou com sucesso no tratamento de desestabilização da superfície do globo anterior (ou seja, a córnea abaulamento) vista em keratectasia do keratoconus e do borne-LASIK. No entanto, aplicação do presente protocolo CXL para a esclera é dificultada por questões relacionadas com dificuldades em acessar a esclera posterior com uma fonte de luz ultravioleta (UV), bem como a necessidade de modificar uma muito maior tecido área de superfície. Que sendo dito, a abordagem CXL tem sido usada para travar o alongamento axial na forma visualmente privado coelhos (por tarsorrhaphy), apesar de várias regiões da esclera posterior necessário várias zonas distintas de irradiação em que estudo³. Por outro lado, a injeção de um agente estabilizador químico (ou seja, agente do cross-linking) através do espaço de sT poderia representar uma forma mais simples para modificar a esclera posterior, evitando a necessidade de introdução de uma fonte de luz UV. Esta técnica de injeção é conhecida como uma maneira útil de induzir anestesia ocular durante procedimentos oftalmológicos, como cirurgia de catarata a^4,5,6. Wollensak⁷ tem descrito anteriormente, o uso de uma injeção de sT usando gliceraldeído (cross-linking agente químico similar em conceito para o formaldeído liberando agentes (FARs) descritos neste estudo) endurecer a esclera coelho e Genipina tem foram mostrados para limitar o comprimento axial em FD cobaias^8,9. Estes investigadores demonstraram uma clara vantagem de usar um agente químico solúvel sobre a técnica CXL fotoquímica. Assim, scleral cross-linking usando um agente químico injetável de algum tipo, incluindo FARs (i.e., TXL)¹⁰, poderia fornecer um método de tratamento viável para deter a progressão do alongamento scleral visto na miopia.

Os protocolos aqui apresentados, usamos uma solução química do cross-linking de hidroximetilglicinato de sódio (SMG), entregada através da injeção de sT para a esclera dos olhos de coelho cadavérico. Temos implementado protocolos semelhantes anteriormente para reticulação química tópica na córnea. Nomeadamente os estudos anteriormente relatados, concentração dependente do cross-linking efeitos pode ser obtida usando SMG, com uma gama de efeito bem acima de abrangência realizáveis com fotoquímico CXL, conforme determinado pela análise de desnaturação térmica¹¹ .

Aqui descrevemos os protocolos para avaliar o efeito do cross-linking de SMG entregada via sT injeções ao tecido scleral, desnaturação térmica utilizando Calorimetria Diferencial de varredura (DSC) e a segunda harmônica geração microscopia (SHGM).

Utilizando Calorimetria exploratória diferencial (DSC), também conhecido como análise térmica, uma transição de desnaturação térmica é medida, que para tecido scleral é predominantemente guiado pelas propriedades dos colagénios fibrillar, desde que eles constituem a maioria em massa da proteína. Este método avalia a estabilidade da estrutura molecular do colágeno e os laços reticulados que estabilizar as fibrilhas de colagénio, a estrutura principal proteína terciária. Durante o aquecimento no DSC, uma temperatura crítica de transição é alcançada que resulta na desnaturação da molécula de colágeno, resultando no desenrolar da tripla hélice, um processo que forma o que é comumente conhecido como gelatina. Esta desnaturação térmica rompe ligações de hidrogênio ao longo da molécula de colágeno e pode ser deslocada para temperaturas mais altas através de métodos do cross-linking induzido^12,13. Este método tem sido usado por muitas décadas, particularmente na indústria de biomateriais e para processos que incluem a fabricação de couro. No entanto, este método requer a extração do tecido esclera e, portanto, só pode ser útil como uma técnica ex vivo .

Microscopia de harmônica de segunda geração (SHGM) baseia-se as propriedades ópticas não-lineares de materiais específicos, com ambientes molecular não-centrossimétricas. Em tais materiais, luz intensa, por exemplo luz produzida por lasers, gera sinais SHG, no qual a luz incidente é duplicada em frequência. Materiais biológicos que são conhecidos para criar sinais SHG são microtúbulos, colágeno e miosina do músculo. Por exemplo, colágeno animado com uma luz infravermelha do comprimento de onda de 860 nm irá emitir um sinal SHG na faixa visível com comprimento de onda de 430 nm. Segunda geração de harmônica (SHG) imagem de sinal é um método promissor para avaliar terapêutico colágeno cross-linking. Tem sido conhecido há mais de 30 anos que fibrilhas de colagénio nos tecidos emitem SHG sinais¹⁴. No entanto, só recentemente podem imagens de alta resolução ser obtidas¹⁵ em uma variedade de tecidos, incluindo o tendão¹⁶, pele, cartilagem¹⁷, vasos sanguíneos,¹⁸e em gel de colágeno¹⁹.

Baseado neste conhecimento, este estudo avalia as alterações de sinal SHG induzidas na esclera através de SMG quimicamente induzida do cross-linking de colágeno. Os resultados indicam que a modificação de SMG da esclera aumenta os sinais SHG produzidos a partir de feixes de fibras de colágeno tecido (a maior ordem quaternária estrutura composta de fibrilas de colágeno) e também produz uma mudança estrutural morfológica em colágeno rede de fibra, refletida na fibra bundle “endireitar”.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados usando olhos de coelho cadavérico dentro de cabeças de coelho outbred intacta. Seguiam-se todos e institucional Nacional orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório. 1. preparação de soluções Preparação de SMG para TXL: Prepare-se 1 mL da concentração de 0,2 M de solução de bicarbonato de sódio (NaHCO3) de solução usando 0,0165 g de NaHCO3 em pó dissolvido em 1 mL de água destilada. …

Representative Results

Temperatura de desnaturação térmica (Tm) como um método de ensaio para avaliar TXL cross-linking efeito: Um total de 16 pares de olhos de coelho foram utilizados nesses experimentos para o procedimento TXL. Como uma parte inicial deste estudo, avaliou-se a localização do efeito do cross-linking induzido por uma única injeção de agente do cross-linking de SMG através do espaço de sT na cabeça coelho cadavérico. Este tipo de experimento tem relevância para o t…

Discussion

Experimentos realizados mostraram evidências que sustentam o uso da microscopia de sinal SHG como um método para avaliação de efeitos na esclera, levantando a possibilidade futura de utilizar esta técnica como uma ferramenta de monitoramento para cross-linking tratamentos do cross-linking de colágeno que destino proteínas de colágeno. De nota, um instrumento já está em uso clínico que potencialmente pode capturar este sinal SHG. Embora este instrumento foi projetado principalmente para imagiologia derme humana…

Materials

MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore, Massachusetts, USA		Double distilled, deionized water. – protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate	Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA		Crosslinking reagent – protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe	BD Eclipse, NJ, USA		Syringe for sub tenon injection. – protocol step 2.1
Rabbit head	La Granja poultry	Outbred	Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. – protocol step 2.2
Tono-pen	Reichter Technologies Depew, NY		IOP measurements – protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler	Perkin-Elmer Waltham, MA, USA		Thermal denaturation analyzer – protocol step 7.4
Pyris software	Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA	Ver 11.0	protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm – protocol step 8.1.1.
GenTeal	Alcon, Fort Worth, TX	B000URVDQ8	Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation – 8.1.1
Chameleon Vision II	Coherent, Santa Clara,CA, USA		Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. – protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	Fixation of the cover slip – protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5	Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA	GG-25-1.5	protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Equipped with a 400-450 nm band pass filter – protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. – protocol step 8.1.8
NIS Elements software	Nikon Instruments, Melville, NY, USA	Ver 4.3	refered to as "software" in the text – protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ	National Institute of Health		protocol step 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	Ver 14	protocol step 9.2.8