Meten van het Effect van chemische stoffen op de groei en voortplanting van Caenorhabditis elegans
Summary
Een basisprotocol te beoordelen van de giftigheid van chemische stoffen in een model dier, Caenorhabditis elegans, wordt beschreven. De methode is geschikt en nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, alsook wat betreft de risico-evaluatie van verschillende milieuverontreinigende stoffen.
Abstract
Toxicologische evaluatie is van cruciaal belang voor het inzicht in de effecten van chemische stoffen op levende organismen op gebied van fundamentele en toegepaste biologische wetenschappen. Een niet-zoogdier bodem ronde worm, Caenorhabditis elegans, is een waardevolle modelorganisme voor toxicologische studies vanwege haar gemak en gebrek aan dierenethiek kwesties vergeleken met zoogdieren dierlijke systemen. In dit protocol, wordt een gedetailleerde procedure voor de toxicologische evaluatie van chemische stoffen in C. elegans beschreven. Een klinische anticancer geneesmiddel, etoposide, die richt zich op menselijk topoisomerase II en DNA-replicatie van menselijke kankercellen remt, werd geselecteerd als een model chemische testen. Leeftijd-gesynchroniseerde C. elegans eieren werden blootgesteld aan dimethylsulfoxide (DMSO) of etoposide, en dan de groei van C. elegans elke dag voor 4 dagen werd bewaakt door de stereomicroscoop observatie. Het totale aantal eieren gelegd vanaf C. elegans behandeld met DMSO of etoposide werd ook geteld met behulp van de stereomicroscoop. Etoposide behandeling sterk beïnvloed de groei en voortplanting van C. elegans. Door vergelijking van het totale aantal eieren gelegd van wormen met verschillende behandeling perioden van chemische stoffen, kan worden besloten dat de giftigheid voor de voortplanting van chemische stoffen op de voortplanting van C. elegans omkeerbaar of onomkeerbaar is. Deze protocollen kunnen nut zijn voor zowel de ontwikkeling van verschillende drugs en de risico-evaluatie van toxische stoffen in het milieu.
Introduction
Toxicologische evaluatie is essentieel voor de ontwikkeling van farmaceutische producten, nutraceuticals, en cosmeceuticals, evenals de risico-evaluatie van verschillende milieu-toxines. Het knaagdier model is een van de meest populaire in vivo de experimentele systemen voor deze studie toxicologie; Als alternatief, bij niet-zoogdieren organismen zoals C. elegans zijn ook op grote schaal gebruikt. Bij niet-zoogdieren toxicologische evaluatiemodellen zijn gunstig vanwege niet alleen dierlijke ethische kwesties, maar ook hun gemak en nut gezien van kosteneffectiviteit, onderhoudbaarheid, snelheid en reproduceerbaarheid1,2 ,3,4.
C. elegans, een bodem ronde worm, als een dier model in diverse fundamentele en toegepaste biologie en scheikunde onderzoek is benut. Het is een 1 mm lange, transparante nematode, die gewoon in vaste of vloeibare Nematode groei Media (NGM) gevoed met de bacteriële stam Escherichia coli OP50 wordt onderhouden. C. elegans heeft een korte levenscyclus en wild-type N2 C. elegans ongeveer 300 eieren legt. Daarom is het gemakkelijk om te worden gebruikt als experimentele materialen3,4,5doorgegeven. C. elegans heeft ook wijd gebruikt in de toxicologische studies van veel drugs en milieuverontreinigende6,,7,,8,9.
Omdat veel antikanker geneesmiddelen snel scheidslijn kankercellen gericht, kunnen ze ook beschadigen snel normale cellen zoals beenmerg, intestinaal epitheel en haarfollikel cellen verdelen. Bijvoorbeeld richten topoisomerase remmende geneesmiddelen op het proces van de replicatie van DNA van kankercellen; ze remmen dus ook snel normale cellen verdelen. Elk levend organisme heeft topoisomereasen, en deze topoisomerase remmers waarschijnlijk gevolgen milieu ecosystemen6,10,11. Dus is een drug toxicologische evaluatie platform met behulp van een model dier waardevol voor zowel de ontwikkeling van geneesmiddelen en de milieurisicobeoordeling.
In dit artikel beschrijven we de gedetailleerde protocollen om te testen van de toxiciteit van etoposide, oftewel een klinische antikanker agent die doelstellingen topoisomerase II, als een model giftige chemische stof in C. elegans. Voor dit doel beschrijven we de meetmethode van lichaamsgrootte en het totale aantal eieren gelegd in C. elegans etoposide behandeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel beschrijven we de evaluatie van de toxiciteit van chemicaliën in C. elegans, een bodem nematode, met behulp van etoposide als een toxische voorbeeld. Voor dit doel gebruiken we twee experimentele omstandigheden. In de eerste set, C. elegans werden geteeld op etoposide met platen van eieren naar de jonge volwassen fase, en vervolgens de wormen werden toegestaan om eieren te leggen op normale NGM platen zonder chemicaliën. In de tweede experimentele set, werden C. elegans voortdu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Korea Instituut voor wetenschap en technologie intramurale onderzoeksbeurs (2E27513) en de hoge toegevoegde waarde voedsel technologie ontwikkeling programma (IPET) gefinancierd door het ministerie van landbouw, voedselvoorziening en Plattelandszaken (315067-03).
Materials
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
Referenzen
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
