Summary

Siero e Plasma copia numero rilevazione mediante PCR in tempo reale

Published: December 15, 2017
doi:

Summary

Questo manoscritto descrive l’analisi di variazione numero copia eseguita nel siero o plasma del DNA usando metodo PCR in tempo reale. Questo metodo è adatto per la stima della resistenza ai farmaci nei pazienti con cancro della prostata resistente alla castrazione, ma potrebbe essere istruttivo anche per altre malattie.

Abstract

DNA libero delle cellule di plasma e del siero (cfDNA) è stato indicato come fonte informativa, non-invasivo di biomarcatori per la diagnosi di cancro, la prognosi, il monitoraggio e la previsione della resistenza al trattamento. Partendo dall’ipotesi che ottenere il numero di copia del gene androgeno recettore (AR) (CN) è un evento frequente nel carcinoma della prostata resistenza di castrazione metastatico (mCRPC), ci proponiamo di analizzare questo evento in cfDNA come potenziali biomarker predittivo.

Abbiamo valutato CN AR in cfDNA utilizzando diversi 2 Real-Time PCR e 2 geni di riferimento (RNaseP e fa1). Quantità di DNA di 60 ng è stato utilizzato per ciascuna combinazione di test. AR Guadagno CN è stata confermata usando PCR digitale come un metodo più accurato. Analisi della variazione di CN sono già stato dimostrato di essere ben informato per la stima della resistenza al trattamento nella cornice di mCRPC, ma potrebbe essere utile anche per altri scopi in contesti diversi pazienti. Analisi CN il cfDNA ha diversi vantaggi: è non invasivo, rapido e facile da eseguire, e si inizia da un piccolo volume di materiale siero o plasma.

Introduction

Del DNA cellulare gratis (cfDNA) nel sangue di circolazione ha dimostrato di essere un’ottima fonte di biomarcatori per la diagnosi di cancro, la prognosi, il monitoraggio e la previsione del trattamento resistenza1,2. Molti studi hanno dimostrato una buona concordanza tra alterazioni del DNA (mutazioni, variazioni del numeri di copie, modificazioni epigenetiche nei tessuti) e quelli che si trovano nel corrispondente al plasma campioni1, confermando che circolanti del DNA del tumore (ctDNA) è informativo per tumore primario e metastatico del tessuto alterazioni3. La possibilità di studiare ctDNA consente così la ricostruzione di riarrangiamenti genomici e variazioni del numero di copia (CNV) presso specifici oncogeni4, identificando potenzialmente metastatiche cellule clonali e subclonal. CtDNA ha dimostrato di essere clinicamente utile soprattutto per il monitoraggio del trattamento del cancro come ospita specifiche mutazioni e CNVs, legate a specifiche terapie mirate5,6. Inoltre supera la necessità per le biopsie del tessuto e permette i risultati ottenuti in tempi diversi durante il trattamento di cancro specifico in modo non invasivo.

Per quanto riguarda il carcinoma della prostata, una correlazione significativa tra circolazione dell’androgeno senza cellula recettore (AR) CNVs e trattamento risposta ad abiraterone ed enzalutamide è stato indicato, indicando numero di AR gene di copia (CN) in cfDNA può essere un promettente biomarcatore in grado di prevedere il trattamento resistenza7,8,9,10,11. CNV di specifici geni in ctDNA possono essere valutati utilizzando diversi approcci con diversa sensibilità, costo e rapidità (ad es. la PCR in tempo reale, digitale e Next Generation Sequencing).

Qui descriviamo un approccio semplice e veloce, basato su analisi duplex in tecnologia PCR in tempo reale, per la valutazione CN AR in cfDNA da campioni di siero e plasma7,8. Abbiamo considerato due differenti saggi PCR progettati su due differenti regioni genomiche all’interno dell’introne 5 di AR (Xq12) e altri due geni, come geni di standard interno di riferimento noti per avere uno status di numero di copia normale nel carcinoma della prostata (RNaseP, Situato su 14q11; Fa1, si trova sul 1 p 34). Abbiamo selezionato i geni di riferimento due, piuttosto che uno, per aumentare la precisione e la sensibilità dei risultati. Una quantità di DNA di 60 ng è stato amplificato per ciascuna combinazione di test (test combinato per AR-assay_1 + RNaseP e per AR-assay_2 + AGO1). Tre campioni di DNA di siero o plasma da maschi in buona salute sono stati riuniti ed usati come calibratore. Abbiamo considerato i tagli di > 1,5 per AR guadagno e < 0,5 per l’eliminazione. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che è flessibile e che altri geni possono essere anche valutati, cambiando i geni di standard di riferimento interno, sulla base di caratteristiche e tipo del tumore.

Protocol

Il protocollo comprende l’isolamento di DNA da campioni di siero o plasma per eseguire Real-Time PCR per l’analisi di numero di copia. Estrazione del DNA, controllo della quantità del DNA (spettrofotometro) e Real-Time PCR per obiettivi specifici sono stati effettuati. In Figura 1, sono riportate una sintesi delle procedure e linea del tempo. Il protocollo segue le linee guida del Comitato di etica umana ricerca IRST. 1. il siero raccolt…

Representative Results

CfDNA totale concentrazione era quantificabile mediante spettrofotometria per tutti i campioni analizzati, mostrando una mediana di 6.12 ng / µ l (gamma: 2.00-23,71 ng / µ l) per i campioni di siero e una mediana di 3,21 ng / µ l (gamma: 2.31-8,49 ng / µ l) per campioni di plasma. Abbiamo analizzato un totale di 115 campioni mediante esperimenti di PCR in tempo reale. Sensibilità del test è stata valutata utilizzando il DN…

Discussion

AR Analisi CN nel campione di siero e plasma rappresenta un nuovo approccio non invasivo per la stratificazione dei pazienti di carcinoma della prostata resistente alla castrazione (CRPC). Recentemente è stato dimostrato che il CN di AR è in grado di prevedere i risultati nei pazienti CRPC trattati con abiraterone ed enzalutamide, prima e dopo la chemioterapia7,8,9,10.

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Chiara Molinari e Filippo Martignano per supporto nell’analisi dei dati.

Materials

BD Vacutainer Serum Tubes Becton Dickinson 367814 whole blood tube for serum
BD Vacutainer EDTA Tubes Becton Dickinson 366643 whole blood tube for plasma
Ethanol absolute VWR the user could use also other companies
TaqMan Copy Number assay Thermo Fisher Scientific 4400291 Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283
TaqMan Copy Number assay (modified) Thermo Fisher Scientific 4467084 Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P Thermo Fisher Scientific 4403326
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4326708 Master mix for Real Time PCR
QIAamp DNA Mini Kit (50) Qiagen 51304 DNA extraction kit
MicroAmp 96-Well Plates Thermo Fisher Scientific N8010560 plates for realt time PCR
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA
7500 Fast Real-Time PCR System Applied Biosystem the user could use also other real time instrument
CopyCaller Software Applied Biosystem Software for copy number analysis

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Salvi, S., Conteduca, V., Martignano, F., Gurioli, G., Calistri, D., Casadio, V. Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR. J. Vis. Exp. (130), e56502, doi:10.3791/56502 (2017).

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