Modello di topo indotta da pentylenetetrazole accensione

Summary

Questo protocollo descrive un metodo di accensione chimica con pentylenetetrazole e fornisce un modello murino di epilessia. Questo protocollo è utilizzabile anche per indagare vulnerabilità per induzione di sequestro e patogenesi dopo crisi epilettiche nei topi.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) è un antagonista del recettore GABA-A. Un’iniezione intraperitoneale di PTZ in un animale induce un acuto, grave sequestro a dosi elevate, mentre le iniezioni sequenziale di una dose di subconvulsive sono state utilizzate per lo sviluppo della chimica dell’accensione, un modello di epilessia. Una singola iniezione di basse dosi di PTZ induce una lieve crisi senza convulsioni. Tuttavia, ripetitivo della basso-dose iniezioni di PTZ diminuiscono la soglia per evocare un grippaggio convulsivo. Infine, la somministrazione continua di basse dosi di PTZ induce un grippaggio tonico-clonic severo. Questo metodo è semplice e ampiamente applicabile per studiare la fisiopatologia dell’epilessia, che è definita come una malattia cronica che coinvolge i sequestri ripetitivi. Questo prodotto chimico legnetti protocollo causa convulsioni ripetitive in animali. Con questo metodo, è stato stimato vulnerabilità alle crisi epilettiche PTZ-mediata o il grado di esasperazione dei grippaggi epilettici. Questi vantaggi hanno portato all’uso di questo metodo per lo screening di farmaci antiepilettici e geni correlati all’epilessia. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato per studiare il danno neuronale dopo i grippaggi epilettici perché i cambiamenti istologici osservati nei cervelli dei pazienti epilettici appaiono anche nei cervelli degli animali ha acceso chimico. Così, questo protocollo è utile per produrre convenientemente modelli animali di epilessia.

Introduction

L’epilessia è una malattia neurologica cronica che è caratterizzata dai grippaggi ricorrenti e colpisce circa l’1% di persone. I meccanismi di generazione di epilettogenesi e sequestro nei pazienti di epilessia non possono essere completamente chiariti negli studi clinici. Di conseguenza, un modello animale adeguato è richiesto per lo studio dell’epilessia¹.

Una varietà di modelli animali di epilessia sono stati utilizzati per studiare la fisiologia di epilessia e per identificare farmaci anti-epilettici^2,3. Tra questi modelli, induzione farmacologica sequestro è un metodo comunemente utilizzato per generare un modello animale per lo studio della patologia di epilessia⁴. Questo metodo è poco costoso e semplice. L’accensione dell’elettrodo-mediata è anche un metodo comunemente usato, ma i costi di questa procedura sono superiori, e il metodo richiede competenze chirurgiche ed elettriche per indurre i grippaggi ripetitivo⁵.

Induzione farmacologica è vantaggiosa anche perché i tempi e il numero dei sequestri sono facilmente controllabili. Modelli genetici murini che presentano crisi epilettiche spontanee sono utilizzati anche nello studio dell’epilessia. Tuttavia, quando e quanto spesso i grippaggi derivano in questi modelli genetici di predizione può essere Impossibile⁶. Un sistema di monitoraggio è necessario per osservare il comportamento epilettico di topi geneticamente modificati⁶.

Acido kainic, pilocarpina e pentylenetetrazole (PTZ) sono ampiamente usati come d’induzione sequestro farmaci⁷. L’acido kainic è un agonista dei recettori del glutammato, e Pilocarpina attiva i recettori colinergici. PTZ è un acido gamma aminobutirrico (GABA)-un recettore antagonista⁸. PTZ sopprime la funzione delle sinapsi inibitorie, portando a un aumento dell’attività neuronale. Il presente regolamento fa sì che i grippaggi generalizzati in animali⁹. Una singola iniezione di acido kainic e Pilocarpina può indurre i grippaggi acuti, soprattutto lo stato epilettico (SE)^10,11 e kainic acido o pilocarpina-mediata SE promuove cronica spontanea e ricorrente grippaggi^{12 , 13}. analisi dei comportamenti e le registrazioni di electroencephalographic (EEG) hanno indicato che i grippaggi ricorrenti spontanei sono osservati un mese dopo una singola iniezione^12,13. Una singola iniezione di una dose convulsiva di PTZ induce anche sequestro acuta. Tuttavia, crisi epilettiche spontanee croniche dopo una singola iniezione di PTZ sono difficili da promuovere. La somministrazione cronica di PTZ è necessaria per indurre i grippaggi ripetitivo¹⁴. In entrambi i metodi, la generazione dei sequestri ripetitivi è in grado di indurre una patologia più simile a quella dell’epilessia umana che la generazione di acuta crisi epilettiche. Nel caso di PTZ, ogni iniezione evoca un grippaggio e severità di sequestro diventa più grave in un modo graduale con ogni iniezione. Infine, una singola iniezione di PTZ della basso-dose induce un grippaggio tonico-clonic severo. In questa fase, ogni iniezione evoca i grippaggi severi. Inoltre, la latenza di grippaggio e la durata anche cambiare nel corso delle iniezioni. La latenza di grippaggio tonico diventa spesso più breve in quest’ultima fase di accensione¹⁵. Inoltre, aggravamento di grippaggio è accompagnato da un sequestro prolungata durata¹⁶. Indagando i meccanismi molecolari che regolano la severità di sequestro, latenza e la durata è utile per lo screening di farmaci anti-epilettici^17,18,19.

I grippaggi sono comunemente indotti da una singola somministrazione sistemica di PTZ, e il recupero è molto veloce, entro 30 min^4,5. Così, il numero dei sequestri è più controllabile nel modello PTZ-accendendo. Tuttavia, monitoraggio EEG ha indicato che picchi generalizzati possono essere visto fino a 12 ore dopo il sequestro di PTZ-mediata²⁰. Pertanto, gli animali devono preferibilmente rimanere sotto osservazione per 24 h dopo le convulsioni miocloniche o tonic²¹ per un’analisi più precisa dei meccanismi di accensione.

La somministrazione di farmaci anti-epilettici, quali etosuccimide, valproato, fenobarbital, vigabatrin e retigabina³, prima o dopo l’iniezione di PTZ mitiga l’esasperazione del sequestro gravità^{3,22, 23}. Allo stesso modo, topi knockout che mancanza geni coinvolti nell’esacerbazione di grippaggio, come matrix metalloproteinase-9²⁴, FGF-22²⁵ e neuritin²⁶, sono stati indicati per esibire la gravità ridotta sequestro dopo iniezioni multiple di PTZ. Inoltre, osservando alterazioni istopatologiche dopo i grippaggi epilettici è possibile con questo metodo. In pazienti con epilessia del lobo temporale, ci sono cambiamenti istologici tipici del cervello, come fibre muscose spuntano^27,28, granello anormale del neurone migrazione²⁹, astrogliosis³⁰, un neurone delle cellule morte nell’ippocampo^31,32e sclerosi hippocampal³³. Simili cambiamenti sono osservati in animali modello epilettico. Tra i metodi disponibili, accensione chimica PTZ-mediata è un metodo buono, riproducibile e poco costoso per produrre un modello animale di epilessia. In un modello SE Pilocarpina-mediata, controllo delle crisi è difficile e molti topi muoiono o non riescono a svilupparsi SE³⁴. Al contrario, la mortalità e la severità di sequestro sono più controllabili nel modello PTZ. Inoltre, PTZ è meno costoso di acido kainic e competenze in chirurgia del cervello del mouse non sono necessarie per l’amministrazione di droga.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di uso del Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science e cura degli animali. Postnatale 8 – 16-settimana-vecchi topi sono raccomandati. Qualsiasi ceppo inbred è accettabile per l’esperimento. Topi C57BL/6 sono più resistenti a PTZ, mentre topi albini BALB/c e svizzeri sono più sensibili a PTZ. C57BL/6 sono stati utilizzati in questo studio. Vulnerabilità di PTZ dipende anche dall’età del mouse. Rispetto ai più giovani topi, topi più vecchi sono …

Representative Results

Iniezione ripetuta di PTZ induce un aumento nella severità di sequestro. Sei topi C57BL/6 sono stati trattati con PTZ, e un altro 6 topi sono stati trattati con soluzione salina come gruppo di controllo. La dose PTZ era 35 mg/kg e 10 iniezioni sono state amministrate. Il Punteggio di grippaggio è aumentato gradualmente con iniezioni di PTZ, considerando che nessun grippaggi o comportamenti anormali sono stati evocati da iniezioni di soluzione salina (Figura 2</stron…

Discussion

Qui, presentiamo un protocollo ampiamente accessibile per l’istituzione di un modello animale farmacologico dell’epilessia. PTZ-mediata accensione chimica ha una lunga storia ed è un modello comunemente accettato per lo studio della patologia istopatologia e cellulare di epilessia⁴¹. Il modello di accensione chimica dell’epilessia è stato rivisto in precedenza da Suzdak e Jansen, 1995⁴². L’induzione farmacologica sequestro, soprattutto con PTZ, è un metodo facile e sempl…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi