骨形成タンパク質 2 固体表面にクリックケミストリーによるサイト向け固定
Summary
骨形態形成タンパク質 2 (BMP2) をドープした生体材料は非組合骨折を癒すために新しい治療戦略として使用されています。因子の手に負えないリリースから生じる副作用を克服するためにサイトに新しい戦略を提案する-従って骨機能の向上と材料を作成する要因を直接固定します。
Abstract
ヒーリング以外の長い骨欠損の治療のための別の治療戦略を集中的に検討しました。骨形成タンパク質 (Bmp) などの骨の成長因子との組み合わせで生体材料の利用につながっているいくつかの制限の現在の処置は現在使用。一般的な吸収またはカプセル化方法には、通常いくつかの深刻な副作用を誘発するいわゆる初期バースト リリース効果に終って BMP2 のスープラ生理量が必要。これらの問題を克服するための可能な戦略は、共有結合タンパク質を足場にカップルことでしょう。さらに、再現性のある製品の結果を保証するために、サイト固有の方法で結合を実行必要があります。したがって、我々 はコドン利用拡大 (BMP2 K3Plk) によって BMP2 タンパク質の成熟した部分に人工アミノ酸 (プロパルギル L-リジン) は導入された BMP2 バリアントを作成しました。BMP2 K3Plk 銅触媒アジ化物アルキンの環化付加反応 (CuAAC) を通して官能ビーズに結合されていました。体外結合 BMP2 K3Plk の生物学的活性が証明され、BMP2 K3Plk 修飾ビーズ貪食は、セルベースのアッセイで証明されました。C2C12 細胞と接触して機能性ビーズがビーズ ローカル制限近接でアルカリ性ホスファターゼ (ALP 活性) 発現を促すことができます。本手法での機能性足場を作り出すことがこのように、骨系統への分化をトリガーすることができます。さらに、BMP2 の低用量で結合 BMP2 のサイト向けの配向を制御のために十分です。この方法では、Bmp は要因がサイト指示されたカップリング技術を介して結合されている場合、そうではない適切な向きで細胞表面上の受容体に常に公開されます。製品の結果が非常に制御可能なしたがって、重要なサイズの修理のための適用性を向上、均質な特性を持つ素材の結果骨の欠陥。
Introduction
骨の組織工学・骨再生の究極の目標は、短所と非組合骨折の一般的な治療法の中に発生する制限を克服することです。自動または同種移植は、いくつかの欠点をもっていても現在の治療戦略として主に使用されます。理想的な骨移植が骨延長術における骨、骨移植片の osteointegration につながると同様、新鮮を誘発します。今日では、のみ自動移植は、理想的な骨移植のすべての特徴を提供するので、「ゴールド スタンダード」と見なされます。残念ながら、それはまた、長い手術時間や通常 (例えば、慢性的な痛み、血腫形成、感染症、化粧品の欠陥、等) の多くの合併症を伴う第 2 外傷サイトなど、重要な負の側面を提示します。同種移植は、一方、すべての一般的な側面1の準の特徴であります。代替骨移植技術は、骨、骨伝導、生体親和性と生体吸収性足場を生産する目的で、ここ数年で改善されています。以来、多くの生体材料はすべてのこれらの骨の特性を示さない、BMP2 と BMP7 は、主にさまざまな成長要因は特定足場2の骨の可能性を改善するためにされています。
必須条件としてこのような成長因子の配信システムは、細胞の動員と添付ファイル、セル成長および血管新生のような重要なイベントを促進するために時間をかけて量を制御リリースを提供する必要があります。ただし、bmp 形式だけでなく、他の骨の成長因子がされている一般的固定非共有結合3。わなに掛ける事と吸着技術の深刻な欠点生体内で骨増殖を誘導することによって周囲の組織に影響を与える一般的につながる初期バースト リリースによる蛋白質の超生理量の使用が必要炎症や腫れ、融解4。したがって、時間の長い期間のための配信サイトで成長因子の保持を共有結合固定化方法で実現できます。BMP2 を化学的に変更 (サクシニル化5、アセチル化6またはビオチン化7) 設計する8、または BMP2 派生オリゴペプチド9を設計されているし、限界を克服するために関連するには吸収。ただし、配置可能性がある細胞の受容体に固定化リガンドの結合を阻害するので、これらの構成体の生物活性は予測できません。前に示したとして活性リガンド-受容体複合体の形成に関与するすべての 4 受容体鎖が完全にすべての下流のシグナル伝達カスケード10をアクティブにするために固定化 BMP2 と対話が不可欠です。
生物活性、安定性、および固定化因子の生体利用率の点で限界の不均質製品結果の問題を克服するためには、共有サイト指示された方法で足場をバインドできる BMP バリアントを設計されています。このバリアントは、BMP2-K3Plk と呼ばれるには、遺伝子コドン拡張11によって導入された人工アミノ酸が装備されています。このバリアントは、その生物学的活性を維持しながら共有結合の結合戦略を使用して足場に正常にリンクされています。
Protocol
Representative Results
Discussion
遺伝子コドンの展開によってタグの蛋白質の変形が主主蛋白質シーケンスの任意の位置でさまざまな非天然アミノ酸類似の導入。BMP2 のような Bmp の場合一般的なタグのような (彼の) 6 ヒスチジンの札はできるだけ protein´s C ターミナル端タンパク質立体構造の中に埋もれた、こうして外からアクセスできないので N 末期に導入されました。他のポジションで導入されたタグのサイズは非常に?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、プラスミド ピロリジル tRNA のエンコーディングを提供して pRSFduet pyrtRNAsynth 対応するアミノアシル tRNA 合成酵素のエンコーディングを提供するため博士 M. Rubini (コンスタンツ、ドイツ) をありがとうございます。
Materials
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | — | — | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | — | — | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | — | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | — | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3– (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | — | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge – 5417R | Eppendorf | — | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | — | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | — | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler – Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | — | PCR |
| TxRed – microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
Referenzen
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