小鼠骨髓基质细胞与骨破骨祖的分离、培养及分化
Summary
本文介绍了从小鼠长骨分离分化骨髓基质细胞和造血干细胞的方法。两种不同的协议, 产生不同的细胞群体, 适合扩展和分化成成骨细胞, 脂肪和破骨。
Abstract
骨髓基质细胞是一种细胞群, 通常用于骨髓间充质干细胞的表达,体外.他们居住在骨髓腔内的造血干细胞 (干细胞), 它可以产生红细胞, 免疫祖细胞和破骨。因此, 从骨髓中提取细胞的数量会导致不同细胞群的混杂, 从而在实验设计和混淆数据解释方面提出挑战。为了获得更多或较不均匀的骨髓基质干细胞和干细胞体, 实验室开发了几种分离和培养技术。在这里, 我们提出两种方法分离骨髓基质干细胞和干细胞从小鼠长骨: 一种方法, 产生混合的人口骨髓基质干细胞和干细胞和一种方法, 试图分离的两个细胞的人口为基础的坚持。这两种方法都提供适合于成骨和脂分化实验的细胞以及功能性的化验。
Introduction
小鼠骨髓间充质干细胞在二十世纪八十年代早期的1中被发现, 通常被作为一个体外细胞模型。事实上, 从长骨的骨髓腔中冲出的塑料黏附细胞的培养, 在许多研究中保持着分化成成骨、破骨、软骨或脂肪的能力2,3,4,5. 然而, 骨髓是一种独特的组织, 由许多不同的细胞组成, 包括但不限于骨髓基质干细胞、干细胞、内皮细胞和免疫干细胞。因此, 分离和培养技术可以产生不同均匀性的细胞群。使用这种技术来测试细胞的分化潜能可能是有挑战性的。例如, 当比较不同基因型的小鼠的细胞时, 从混合细胞的数量开始限制对数据的解释。相反地, 获得骨髓基质干细胞和干细胞的同源种群在技术上是困难的, 可能不代表前体模型。
在我们的实验室里, 我们主要关注骨髓基质干细胞的利用, 因为它们有可能被分化成成骨细胞、破骨和脂肪。在这里, 我们提出了骨髓基质干细胞和干细胞分离和培养技术, 用于评估 osteoblastogenesis 或成的体外, 以及干细胞的培养, 以分化为破骨细胞。一种方法是利用混合的骨髓细胞 (bmc), 其中含有骨髓基质干细胞和干细胞直接适合成, osteoblastogenesis 和破 (称为总 bmc)。这种方法更接近于在骨髓微环境的细胞中发现的异质性的活体。另一种方法是将黏附在换药细胞中, 试图培养 “更纯净” 的骨髓基质干细胞和干细胞 (称为黏附骨髓基质干细胞) 的种群。后来的方法允许细胞培养实验开始与更准确的数量的骨髓基质干细胞或干细胞, 并降低潜在的复杂的间接影响的其他细胞的人口留在文化中。这两种方法以前都已发布, 用于解决不同的研究问题6,7,8,9。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了两种骨髓基质细胞的培养方法及其优点和局限性。从骨髓中分离出来的细胞是一个相对轻松的过程。然而, 由于骨髓腔的细胞环境的多样性, 获得细胞间充质干细胞或破祖先的代表可能具有挑战性。
培养完整的骨髓的内容提供了一个密切的表示,在体内微环境。然而, 分离细胞从不同的小组小鼠 (基因型, 治疗, 年龄,等) 可能导致一个非常不同数量的骨髓?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院 (R01 AR061164-01A1) 的支持。
Materials
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
Referenzen
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