Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato
Summary
Il seguente protocollo si concentra sulla creazione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato (STS). Questo modello potrebbe aiutarci a comprendere meglio le priorità bassa molecolare e il profilo farmacologico di queste malignità rare e potrebbe rappresentare un punto di partenza per ulteriori ricerche finalizzate a migliorare la gestione di STS.
Abstract
Sarcomi dei tessuti molli (STS) rappresentano uno spettro di neoplasie eterogenei con un difficile diagnosi, classificazione e gestione. Ad oggi, sono state identificate più di 50 sottotipi istologici di questi rari tumori solidi. Così, grazie alla loro straordinaria diversità e bassa incidenza, la nostra comprensione della biologia di questi tumori è ancora limitato. Paziente-derivato culture rappresentano la piattaforma ideale per studiare la farmacologia e la patofisiologia di STS. Così abbiamo sviluppato un modello preclinico umano di m. a partire da esemplari del tumore raccolti da pazienti sottoposti a resezione chirurgica. Paziente-derivato di colture cellulari STS sono sono ottenuti da esemplari chirurgici di digestione della collagenosi e isolati mediante filtrazione. Cellule sono stati contati, seminate e lasciate per 14 giorni in colture monostrato standard e poi elaborate da analisi a valle. Prima di eseguire l’analisi molecolare o farmaceutici, l’istituzione di colture primarie di STS è stata confermata attraverso la valutazione delle caratteristiche citomorfologiche e, quando disponibili, gli indicatori immunohistochemical. Questo metodo rappresenta un utile strumento 1) per studiare la storia naturale di queste neoplasie scarsamente esplorate e 2) per testare gli effetti di diversi farmaci nel tentativo di saperne di più su loro meccanismi di azione.
Introduction
Sarcomi dei tessuti molli (STS) includono una gamma di lesioni eterogenee della contabilità di origine mesenchimale per 1% di tutti i tumori solidi1,2, e la nuova classificazione dell’organizzazione mondiale della sanità riconosce la presenza di più di 50 diversi sottotipi3. Tra questi, gli istotipi più comuni sono del adipocyte sarcoma o liposarcoma e leiomiosarcoma, pari al 15% e 11% di tutte le m adulte, rispettivamente4,5. Anche se STS può svilupparsi in diverse parti del corpo, le estremità e il retroperitoneum sono i siti più comuni, che si verificano nel 60% e il 20% dei casi, rispettivamente6.
La pietra angolare della terapia per la malattia localizzata è la resezione chirurgica larga, considerando che i benefici della chemioterapia adiuvante e neoadiuvante sono ancora poco chiari e vengono considerati solo in casi selezionati7. In metastatica, la chemioterapia è lo standard di cura ma Mostra risultati limitati8. Una migliore comprensione della biologia molecolare di STS contribuirebbe a migliorare la diagnosi differenziale corrente, ottimizzare i trattamenti disponibili e identificare nuovi bersagli per la terapia.
In questo contesto, la ricerca sul cancro è stata eseguita per molti anni di utilizzo di linee cellulari immortalizzate9. Questi modelli sperimentali sono normalmente coltivati in monostrato standard supporta o impiantati nei roditori immunodeficienti per stabilire modelli in vivo dello xenotrapianto10. Linee cellulari immortalizzate rappresentano un materiale maneggevole e facile-a-store, con la quale un ampio numero di esperimenti di ricerca può essere eseguito. Sono, infatti, il meno costoso e più ampiamente usato strumento in studi preclinici11.
Tuttavia, modelli di base di cellula del cancro hanno anche alcune limitazioni, ad es. prolungata cultura in un sistema monostrato insieme a un numero crescente di passaggi induce fenotipica e deriva genetica, facendo le cellule meno probabile di ricapitolare chiave tumore caratteristiche. Inoltre, colture cellulari linea non riescono a riprodurre l’interazione cellula–cellula e la segnalazione area interattiva di molecola che imitano il comportamento biologico dei tumori e caratterizzano il microambiente tumorale. Questi problemi costituiscono la base del divario esistente tra risultati preclinici e clinici12.
Dato quanto sopra, l’interesse in colture primarie di paziente-derivato è aumentato13. Infatti, l’asportazione del tessuto maligno e normale riduce il rischio di perdere il fenotipo delle cellule di cancro ed eterogeneità, offrendo così il materiale di partenza che è più rappresentativo del microambiente tumorale. Inoltre, l’uso di campioni tumorali freschi raccolti da pazienti sottoposti a resezione chirurgica permette di indagare i singoli tumori e per confrontare diverse lesioni dalla stessa parte del corpo di un paziente14. Per i motivi suesposti, colture di cellule tessuto-derivate forniscono un materiale prezioso per studiare il tumore fisiopatologia e farmacologia15,16,17, soprattutto nella m. a quali linee di cellule di sarcoma commercialmente disponibili sono limitato18. Abbiamo così ottimizzato un metodo per stabilire una cultura cellula primaria STS paziente-derivati a partire da tumore chirurgicamente asportato tessuto13,19,20. Il nostro metodo consiste di disgregare l’esemplare del tumore in piccoli frammenti di tessuto seguiti da una notte dissociazione enzimatica del tessuto per ottenere una sospensione di singola cellula. Il giorno seguente, la digestione enzimatica viene arrestata con l’aggiunta di terreni di coltura fresco e la sospensione ottenuta viene filtrata per rimuovere frammenti di tessuto, aggregati cellulari e materiale in eccesso matrice o detriti. Infine, una frazione di cellule isolate del tumore è cytospinned su vetrini, fissato e memorizzati per analisi a valle puntato su confermando l’istituzione di colture primarie di STS da cytomorphological, immunohistochemical e valutazione citogenetica molecolare (ad es. analisi dei pesci di amplificazione MDM2 rappresenta la diagnosi differenziale standard per un liposarcoma bene-differenziato e il liposarcoma dedifferentiated) 4. le cellule restanti sono seminate in una cultura standard monostrato per studi farmacologici e profilatura di espressione genica. Tutti gli esperimenti sono effettuati utilizzando basso passaggio colture primarie per evitare la selezione di cancro specifico subcloni e analizzati da un patologo esperto sarcoma. Così abbiamo creato un pienamente umano m ex vivo modello13,19,20. Questo altamente versatile, facile da maniglia modello potrebbe rappresentare uno strumento utile per diversi tipi di ricerca preclinica, ad esempio per identificare nuovi marcatori molecolari per la diagnosi e la prognosi o per acquisire una più profonda comprensione dell’attività e meccanismi di azione di standard e nuovi farmaci utilizzati nella gestione delle m.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ben definiti modelli preclinici sono necessari delucidare la priorità bassa molecolare dei tumori, predire la prognosi e sviluppare nuove strategie terapeutiche per i pazienti oncologici. Ciò è particolarmente importante per i tumori rari ad esempio STS cui alta eterogeneità in termini di morfologia, comportamento aggressivo di potenziale e clinico sfida la nostra comprensione della biologia di STS e gestione del paziente21. Inoltre, le poche righe di cellule di sarcoma commerciale disponibile…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Gráinne Tierney per assistenza editoriale.
Materials
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
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