신경 대 식 세포 공동 문화 Neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포를 활성화 하
Summary
현재 프로토콜 neurite 결과 홍보 하는 분자 요인 출시 용량 부여 배양된 세포를 자극 하는 실험 절차를 제공 합니다. 치료 신경 macrophage 공동 문화 캠프의 강한 neurite 결과 활동을가지고 바른된 매체를 생산 하는 세포를 유도 합니다.
Abstract
세포 재생 또는 손상 신경 복구에 참여할 수 있는 강력한 증거가 있다. 여기, 우리 세포 생산 조절 매체 (CM) neurite 결과 촉진 유도 된다 프로토콜을 설명 합니다. 성인 지 루트 신경 절 (DRG) 뉴런 심하게 해리 하 고 도금. 뉴런 안정적으로 연결 하 고, 후 복 막 대 식 세포는 잘 동일한 중첩 셀 문화 삽입에 공동 경작. Dibutyryl 순환 앰프 (db-캠프) 후 세포 배양 삽입 대 식 세포를 포함 하는 24 시간에 대 한 공동 문화에 적용 됩니다 다른 잘 CM 72 h에 대 한 수집을 이동 합니다. 별도 성인 DRG 신경 문화에 적용 될 때 db-캠프로 치료 공동 문화에서 CM 강력한 neurite 결과 활동을 전시 한다. 혼자 단일 셀 형식의 구성 된 db 캠프 대우 문화에서 얻은 CM, DRG의 신경 또는 복 막 대 식 세포, neurite 결과 활동을 전시 하지 않았다. 이 신경 세포와 세포 사이의 상호 작용은 CM에 neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포의 활성화를 위한 불가결 하지 나타냅니다. 따라서, 우리의 공동 문화 패러다임 프로 재생 형으로 부여를 대 식 세포를 자극 하 신경-대 식 세포의 상호 작용에서 세포 신호 공부 유용할 또한.
Introduction
다양 한 연구는 척수 또는 뇌의 부상 후 CNS 축 삭 재생을 강화 하고자 했다. 염증 성 반응, 신 경계에 상해를 필연적으로 동반 해로운 결과1,2에 지도 하는 보조 병 적인 프로세스에 참여 하도록 전통적으로 생각 된다. 실제로, 염증 반응 억제 수 있습니다 methylprednisolone 급성 척수 부상3에 대 한 유일한 승인 된 치료입니다. 그러나, 최근 연구 제공 증거 대 식 세포, 대표적인 염증 성 세포 유형, 재생 또는 부상된 신 경계4,,56의 수리에 참여할 수 있습니다. 예를 들어 다음과 같은 렌즈 부상 생산 프로 재생 분자 망막 신경 절 신경7,8의 재생을 촉진 하는 대 식 세포 침투. 또한, 이식된 DRG 신경 축 삭 성장 세포 zymosan9에 의해 활성화 된 지역까지 증가. 또한, 병 변 사이트에서 대 식 세포는 부상된 주변 신경10성장 허용 환경을 만들 수 있습니다.
우리의 일은 또한 대 식 세포는 인접 한 뉴런의 축 삭 재생의 용량에 기여할 수 있는 강력한 증거 제공. 우리 느 루트 신경 절 (DRG)에서 대 식 세포의 활성화 했다 나타났습니다 DRG의 향상 된 재생 능력에 필수적인 감각 신경을 따라 늘어진 주변 신경 상해11. 비슷한 연구 독립적으로 다른 실험실12에서 보고 되었다. 우리는 또한 dibutyryl 축 삭 재생13의 용량을 강화 하는 잘 알려진 분자 인 순환 앰프 (db-캠프)의 intraganglionic 주입 대 식 세포의 활성화를 유발을 보여주었다. 대 식 세포의 비활성화 폐지 neurite 결과 활동에 db 캠프의 효과. 후속 작품 부상 유도 식 CCL2의 뉴런에 프로 재생 형14,15대 식 세포를 자극 하는 신호를 확인.
위의 실험 결과 바탕으로, 우리는 체 외에서 모델 닮은 Drg preconditioning 부상 모델11,14다음에 발생 하는 분자 이벤트를 설립 했다. 이 모델에서는 db-캠프 프로 재생 형으로 대 식 세포의 활성화에 이르게 신호 세포 도출 신경 macrophage 공동 문화에 적용 됩니다. 여기, 우리는 우리가 분자 요인 홍보 neurite 결과 (그림 1)을 분 비 하는 세포를 생성할 수 있습니다 자세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험적인 모델 세포 자극 하 하거나 신 경계에 상해 다음 축 삭 재생을 지원 하기 위해 유도 수 개념을 보여 줍니다. 우리의 모델 프로 재생 세포의 활성화에 지도 하는 세포 신호 메커니즘을 공부에 유용할 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 공동 문화 시스템의 생성에 대 한 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 그것은 마우스 DRG 신경 및 복 막 대 식 세포가 신선한 준비는 되었는지 확인 하는 것이 중요 하 고 건강 한입니다. 우리 모든 Drg의 해 부 했다 30 분 이상 CM의 저하 neurite 결과 활동을 경험 했다. 또한, 복 막 대 식 세포 구성 요소 혈액의 오염 또한 CM에 neurite 결과 활동의 감소에 지도 했다. Db-캠프로 강력한 신경-대 식 세포 상호 작용…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜은 NRF-2015R1A2A1A01003410 사역의 과학, 정보 통신, 미래 계획, 한국에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
Referenzen
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