Volumen es un parámetro importante en cuanto a las características fisiológicas y patológicas de las células. Se describe un método de exclusión fluorescente que permite medición de campo completo en vitro volumen neuronal con sub-micrométrica resolución axial necesaria para el análisis de neuritas y estructuras dinámicas implicadas en el crecimiento neuronal.
Volumen es un parámetro importante en cuanto a características fisiológicas y patológicas de las neuronas en diferentes escalas de tiempo. Las neuronas son células bastante singular en cuanto a su morfología ramificada extendida y en consecuencia plantear algunos retos metodológicos para la medición de volumen. En el caso particular de en vitro crecimiento neuronal, la metodología solicitada debe incluir sub-micrométrica resolución axial combinada con la observación de campo completo en escalas de tiempo de minutos a horas o días. A diferencia de otros métodos como en la reconstrucción de la forma de la célula usando proyección de imagen confocal, medidas eléctricamente o microscopía de fuerza atómica, el recientemente desarrollado método de exclusión de fluorescencia (FXm) tiene el potencial para cumplir con estos desafíos. Sin embargo, aunque es simple en su principio, aplicación de una alta resolución FXm para neuronas requiere ajustes múltiples y una metodología dedicada. Aquí presentamos un método basado en la combinación de la exclusión de fluorescencia dispositivos microfluídicos múltiples compartimientos de baja rugosidad y finalmente micropatterning para lograr en vitro las medidas de volumen neuronal local. El proporcionado por el dispositivo de alta resolución nos permite medir el volumen local de procesos neuronales (neuritas) y el volumen de algunas estructuras específicas involucradas en el crecimiento neuronal, tales como conos de crecimiento (GCs).
El conocimiento preciso del volumen celular ha atraído mayor atención en los últimos años, impulsado por el tema de la homeostasis del tamaño celular en solos-celled microorganismos 1 y en general en las células mitotic 2. Sin embargo, es pertinente también para las células post mitóticas, para que las neuronas constituyen un ejemplo paradigmático la cuestión del volumen de la célula.
Volumen es una importante firma de eventos fisiológicos y patológicos en diferentes escalas y puntos de tiempo en la vida neuronal, de la deformación axonal transitoria asociada a actividad eléctrica (escala de milisegundos) 3 a la irreversible neuronal de la hinchazón que ocurre durante la fase asintomática de neurodegenerativas enfermedades (años en los seres humanos) 4. Sin embargo, el mayor cambio de volumen se produce en una escala de tiempo intermedio de días o semanas (dependiendo el organismo considerado) durante el crecimiento neuronal. La prolongada y compleja morfología de neuronas plantea cuestiones múltiples, entre los que la regulación del tamaño celular. Diámetro y longitud axonal son de hecho fuertemente regulado en vivo, con valores específicos para cada tipo neuronal 5,6.
Estos temas, complejos de abordar en vivo, también pueden abordarse de manera simplificada in vitro. En ese objetivo, un método dedicado a la medición de volumen rápido lo suficiente como para seguir la dinámica de crecimiento (es decir, en una escala de tiempo de minutos) y compatible con la observación durante horas o días se requiere. Varios métodos se han desarrollado sobre los años para proporcionar un acceso directo o indirecto a volumen celular in vitro. Reconstrucción de la célula de proyección de imagen confocal es uno de ellos, pero este método implica el etiquetado y repetidas exposiciones a la luz al tiempo que muestra una limitada resolución axial de aproximadamente 500 nm 7. Tenga en cuenta que estos dos últimos inconvenientes son parcialmente inundados por un método más sofisticado y reciente llamado enrejado de la microscopia de luz-hoja 8. Microscopía de fuerza atómica ha utilizado 9 pero este método de análisis es por esencia lenta y tediosa. Por otra parte, el contacto físico que requiere la célula podría interferir con la medición teniendo en cuenta la extrema suavidad de neuronas 10. Método indirecto utilizando la impedancia o resonancia han sido empleados para 11tipos de células diferentes, pero son insuficientes para extendido adhesivo células como las neuronas.
Uno de los métodos más prometedores se basa en la medida del volumen excluido de las células en una cámara estrecha llenado de un colorante fluorescente. El método de exclusión de la fluorescencia (FXm) es simple en su principio, ya que no requiere etiquetado y es adecuado para imágenes ópticas rápido, de largo plazo de poblaciones celulares con una resolución axial potencialmente el óptica. Más precisamente, la resolución en z depende de la intensidad de la fluorescencia máxima en el compartimiento de la cultura (es decir, en la región carente de células) dividida por el rango dinámico de la cámara, aunque varias fuentes de ruido de limitan esta última resolución. Este método ha sido muy fuerte el volumen de la migración de células adherentes 12 o para el estudio de cambio de volumen durante la mitosis de células de mamífero, como bien se describe en el 13. Sin embargo, las neuronas constituyen un desafío metodológico para grandes teniendo en cuenta su extensa ramificación en procesos sub-micrométricas.
Aquí presentamos un método que conduce a la fabricación de cámaras grandes lisas para obtener con alta precisión el volumen y la altura de ramas neuronales y estructuras dinámicas en crecimiento neuronal como conos de crecimiento.
Cámaras deben tener alturas similares que el objeto a medir con el fin de optimizar la resolución axial. Por lo tanto, hemos diseñado diferentes dispositivos de FXm caracterizados por cámaras de medición central de tres alturas diferentes. El más delgado (3 μm de altura) se dedica a la medición de neurita: esta altura baja excluye soma, que permanecen en la cámara intermedia alta cerca de 15 μm. Cámaras central más gruesos (10 a 12 μm) son lo suficientemente altas para seguir el crecimiento de células enteras. El dispositivo incluye también dos embalses situados a ambos lados de la cámara central. Cuatro agujeros de inyección (IH) así se implementan y se señalan como sigue: la entrada y salida sirven para introducir las suspensiones celulares en el chip, mientras que los otros dos alimentan a los embalses.
Tenemos primera calibración fabricados cubreobjetos para mediciones de altura con fotoresistencia estructuras de geometría conocida. Entonces hemos reflejado las neuronas cada vez más libres, pero también morfológicamente limitadas neuronas en micropatrones de adhesión.
Proyección de imagen de volumen de neuronas constituye un reto para la técnica de grandes debido a las extensiones de estas células largas y delgadas. Este protocolo describe las variantes del mismo tipo de dispositivo de microfluidos dedicada a la proyección de imagen de la neurona.
Al lado de los aspectos de diseño microfluídico, la elección del objetivo es fundamental para la proyección de imagen de exclusión de la fluorescencia e implica un compromiso entre la resolución lateral y la claridad de la imagen. Se ha demostrado en el 13 que un NA alta conducen a una profundidad de foco más pequeño que la altura de cámara no era perjudicial para la precisión de la medición de volumen si se realizó la proyección de imagen en foco y si se deja un margen suficiente entre el contorno del objeto del os intereses y los límites de la superficie de integración. Sin embargo, el uso de una cámara muy superior a la profundidad del foco impide la claridad de la imagen debido a la difusión del fotón, que suaviza los bordes de los objetos de interés. La fabricación de una cámara alta de 3 μm redujo este desenfoque lateral y proporciona imágenes excepcionalmente definidas exclusión fluorescente con NA alto (0,8) 40 X objetivos visualizar ramas neuronales con alta resolución lateral.
Chip de montaje es un paso crítico, en particular en el caso de alta cámaras de 3 μm, pero manipulación cuidadosa tal como se describe en el punto 4.1.2 evita el colapso del techo. La superficie alta al cociente del volumen asociado a estas cámaras delgadas también planteó la cuestión de la estabilidad de la concentración de dextranos en el tiempo. Hemos comprobado que la absorción superficial del dextrán después de una noche de incubación era insignificante: después de reemplazar el dextrano por PBS, la diferencia de intensidad entre el pilar y el fondo era de 1 por 1000 del contraste de intensidad inicial entre estas dos regiones en presencia de dextrano. Nota que las neuronas pueden adherirse sobre el cubreobjetos de la parte inferior y en el techo PDMS. Este efecto desaparece cuando usando modelado cubreobjetos (es decir, cuando no incubar adhesivo moléculas dentro de la cámara PDMS), como la capa es por lo tanto estrictamente localizada en la parte inferior de la cámara.
Aparte de su morfología desafiante, las neuronas son más bien adecuadas para grandes debido a que uno de la gran limitación del método, es decir, endocitosis de dextrano, es muy limitado en estas células. Elegimos un 10 kDa formulación para suprimir a largo rango (horas) cualquier fenómeno de endocitosis visible.
En conclusión, la simplicidad conceptual de FXm es balanceada por un conjunto de temas experimentales que han sido resueltos por el presente Protocolo, tales como rugosidad nanométrica de PDMS y altura de cámara micrométrico o corrección de fondo para corregir las irregularidades de el techo de PDMS entre pilares. Sin embargo, el uso de una cámara estrecha microfluídicos para limitar el medio fluorescente produce algunas limitaciones como la necesidad de pilares de apoyo, que reduce la superficie efectiva disponible para la adhesión celular, o la necesidad de excluir el soma de la central cámara para observar extensiones neuronales con la mayor claridad, que limita las regiones de la célula accesible a la observación de alta resolución. Una posible evolución de este método sería deshacerse de este confinamiento físico, para ser reemplazado por una óptica. El nuevo desarrollo de la microscopía de luz de hoja puede combinarse ventajosamente con grandes en el futuro.
The authors have nothing to disclose.
Los autores quieren reconocer ChiLab, materiales y laboratorio de microsistemas – Politecnico di Torino – DISAT, en la persona del Prof. C F Pirri, Dr. M Cocuzza y Dr. S L Marasso, por su precioso apoyo en el proceso de desarrollo y fabricación del dispositivo. Agradecemos a Víctor Racine de Quantacell para la discusión y apoyo en el tratamiento de la imagen. Agradecemos a Isabelle Grandjean y Manon Chartier de la facilidad Animal del Instituto Curie por su apoyo para los ratones y Pablo Vargas y Ana María Lennon (Instituto Curie) por facilitarnos los ratones LifeAct de GFP. Agradecemos a Olivier Thouvenin del Institut Langevin y Clotilde Cadart, Larisa Venkova y Matthieu Piel de Instituto Curie – 144 UMR, por su ayuda en la comprensión de la exclusión de fluorescencia método. Por último, agradecer a la plataforma tecnológica de Institut Pierre-Gilles de Gennes (CNRS UMS 3750) por su apoyo en microfabricación. Este trabajo fue apoyado en parte por el Europeo investigación Consejo Advanced Grant no. 321107 “CellO”, Université de PSL (proyecto SwithNeuroTrails), ANR Investissement Avenir y la empresa Labex IPGG y Equipex.
Equipments | |||
Plasmalab System 100 | Oxford Instruments | To perform DRIE | |
MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | SU-8 photolithography | |
NXQ 4006 Mask aligner | Neutronix Quintel | Photolithography associated to DRIE | |
Plasma cleaner | Diener Electronic | Pico PCCE | |
Cell culture hood | ADS Laminaire | Optimale 12 | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Multifuge X1R | |
Incubator 37 °C 5% CO2 | Panasonic | MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMi8 | |
PDMS Oven between 65 and 80 °C | Memmert | ||
Mechanical profilometer | Veeco | Dektak 6M Stylus Profiler | |
Optical profilometer | Veeco | Wyko NT9100 | |
Vacuum desiccator | Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware) | 230KAR | Diameter 200 mm |
Ultrasonic bath sonicator | Labo Moderne | SHE1000 | Volume of the bath: 0.8 liter |
Hotplate | Stuart SD162 | SD162 | |
Masks | |||
DRIE | Supplementary data | ||
Su8 Mask 1 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 2 | Supplementary data | ||
Su8 Mask 3 | Supplementary data | ||
S1805 calibration stripes | Supplementary data | ||
Small laboratory equipment | |||
1.5 mm hole puncher | Sigma-Aldrich | 29002519 (US reference) | |
Scalpel or razor blade | |||
9" Stainless Steel Flat Spatula with Spoon | VWR International | 82027-532 | To demold PDMS |
Top Lip Wafer Handling | VWR International | 63042-096 | |
Curved tweezer | FST | Dumont #7 Forceps – Standard / Dumoxel | To manipulate glass coverslips |
Substrates | |||
Silicon wafer | Prolog Semicor Ltd | ||
24×24 mm glass coverslips | VWR | 631-0127 | |
Photoresists and developpers | |||
AZ 1518 positive photoresist | Microchemicals GmbH | Before DRIE process, thicknes 1.8 µm | |
AZ 351B developer | Microchemicals GmbH | To develop positive AZ 1518 photoresist | |
SU-8 2007 | MicroChem | ||
SU-8 2025 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
PGMA developer | Technic | To develop SU-8 negative photoresist | |
Microposit S1805 resist | Chimie Tech Services | Positive photoresist used to obtain 0.5µm high structures | |
MF 26A developer | Chimie Tech Services | To develop positive S1805 photoresist | |
Laboratory consumables | |||
Disposable plastic pipette 3 mL | LifeTechnologies – ThermoFisher | ||
P100 Petri dishes | TPP | 93100 | |
20 mL syringe | Terumo | SS+20ES1 | |
Transparent scotch tape | |||
Square wipes | VWR | 115-2148 | |
Parafilm | DUTSCHER | 90260 | Plastic paraffin film |
Chemicals | |||
(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane | abcr | AB 109004 | |
PDMS and curing agent Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761036 | |
isopropanol | W292907 | ||
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 – 50 mL | |
Ethanol absolute | Sigma-aldrich | 02865 | 99.8% |
3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane | Sigma-aldrich | M6514-25ML | (C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3 |
acetic acid | Sigma-aldrich | 71251-5ML-F | |
Dextran 10kW conjugated with Alexa488 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22910 | Absoprtion at 488 nm |
Dextran 10kW conjugated with Alexa647 | LifeTechnologies – ThermoFisher | D22914 | Absoprtion at 647 nm |
Culture medium | |||
MEM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21090-022 | |
Horse Serum | LifeTechnologies – ThermoFisher | 26050088 | |
B27 | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12587-010 | |
Glutamax 200 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM | LifeTechnologies – ThermoFisher | 11360-070 | |
Gentamicin | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15710-049 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
HBSS 10x | LifeTechnologies – ThermoFisher | 14180-046 | |
Hepes 1M | LifeTechnologies – ThermoFisher | 15630-056 | |
trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | |
Neurobasal | LifeTechnologies – ThermoFisher | 21103-049 | |
Neurobasal without phenol red | LifeTechnologies – ThermoFisher | 12348-017 | |
Softwares | |||
Routine in Matlab for background normalization | Quantacell | Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com | |
ImageJ | To select specific ROI for image analysis | ||
Routine | ImageJ | Supplementary data | |
Routine | Matlab | Supplementary data |