Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה
Summary
שתכננו את החלבון capsid של וירוס הפטיטיס E כמו ננו-חלקיק theranostic (HEVNP). HEVNP עצמי מרכיבה לתוך כלוב icosahedral יציב במשלוח הרירית. כאן, אנו מתארים את השינוי של HEVNPs לגידול מיקוד על ידי מוטציה השטח החשופים שאריות אל cysteines, אשר נזווג סינתטי ליגנדים שקושרים במיוחד תאים סרטניים.
Abstract
חלקיקים דמויי וירוס (האח מים) שימשו nanocarriers להציג epitopes זרים ו/או לספק מולקולות קטנות זיהוי וטיפול במחלות שונות. יישום זה מסתמך על ההנדסה הגנטית, הרכבה עצמית, ציסטאין ההטיה כדי למלא את היישום פילוח הגידול של האח מים רקומביננטי. לעומת גנטי מציע שינוי לבד, כימיה ההטיה של פפטידים זרים כדי האח מים משמעותי יתרון משום שהיא מאפשרת מגוון רחב של גופים, כגון peptides סינתטי או oligosaccharides, כדי להיות מצומדת השטח של האח מים בצורה מווסתת ו גמיש ללא שינוי של מכלול האח מים.
. הנה, נדגים כיצד להשתמש את הפטיטיס E וירוס ננו-חלקיק (HEVNP), modularized theranostic קפסולה, כנשא משלוח רב תכליתיים. פונקציות של HEVNPs כוללים פילוח רקמות, הדמיה ומסירת טיפולית. בהתבסס על המחקר המבני ומבוססת של HEVNP, משקעי מבנית עצמאית, השטח החשופים נבחרו עבור החלפת ציסטאין כאתרי ההטיה לקבוצות מקושרים maleimide כימי באמצעות קישורים תיול-סלקטיבית. אחד מסוים ציסטאין-השתנה HEVNP (תחליף Cys של אספרגין-573 aa (HEVNP – 573C)) היה מצומדת השד סרטן תאים ספציפיים ליגנד, LXY30 ומוענקת -סגול (ניר) זריחה צבען (Cy5.5), עיבוד של הגידול, ממוקדות HEVNPs כמו קפסולות אבחון יעיל (LXY30-HEVNP-Cy5.5). אסטרטגיות הנדסיות דומה יכול להיות מועסק עם שאר מכלולי macromolecular עם הבראבה ידועים לחקור יישומים פוטנציאליים משלוח theranostic.
Introduction
הפיתוח של וקטורים בגודל ננו במשלוח איבחוניות, המכונה nanotheranostics, השתנתה הרבה בתחום הביו-רפואי מן הטיפולים כללית לקראת משלוח ממוקד1 משלוח nanotheranostic יישוב משתלב בגודל ננו וקטורים (חלקיקים) עם מולקולות theranostic לכוון stably theranostic מולקולות ספציפיות רקמה חולה או מסלול ביוכימי2,3,4 . ננו-רפואה הגיע לחזית של משלוח ממוקד כי חלקיקים בגודל אופטימלי יש את היכולת לייצב את זרימת הדם של מולקולות theranostic, באופן סלקטיבי היעד מולקולות על פני התא המוצג לרקמות החולות. פלטפורמות nanotheranostic רבות עדיין סובלים ספיגת תא פסיבי, השפלה טרום בוגרת, רעילות, האגודה לא מספיקות מולקולות theranostic. האח מים להתגבר על הרבה מכשולים אלה במשלוח ממוקד. הם שימשו nanocarriers להציג epitopes זרים ו/או לספק מולקולות קטנות: משטר יכול לשמש כדי להילחם במחלות רבות1. יישום זה מסתמך בעיקר על הרכוש של הרכבה עצמית כמו גם להקל על שינויים גנטיים, כדי למלא את היישום תוכנן עבור האיש החשוב נתון. בהשוואה להנדסה גנטית, ההטיה כימי של פפטידים זרים כדי האח מים מציג יתרון משמעותי משום שהוא מאפשר מגוון גדול של ישויות, כגון פפטידים או oligosaccharides, כדי להיות מצומדת השטח של האח מים ב מאופנן ו באופן גמיש ללא שינוי של האח מים הרכבה.
HEVNPs, נגזר HEV capsid חלבון רקומביננטי, 2nd פתח קריאה מסגרת (ORF2), הם שאינן זיהומיות, הרכבה עצמית capsids מסוגל התא מחייב כניסה. כי HEV התפתח לשידור הרירית, החלבון capsid שהורכב יציב באופן דומה הפרוטאוליטי ותנאי הרירית חומצי5. HEVNPs טופס חלול, T = 1 icosahedral capsid, המורכב 60 יחידות זהות6,,7 , של ORF2, טיוח זה יציב מאוד גם אחסון וגם בתנאים פיזיולוגיים קשים. חסר כל מרכיבים גנטיים ויראלי, תשואה גבוהה, יעילות הייצור מושגת באמצעות מערכת baculovirus ביטוי בתאי חרקים. בגלל היציבות הפרוטאוליטי שלהם, HEVNPs עצמית שהורכב חילוץ, מטוהרים מן התא תגובת שיקוע, נחוץ טיהור צעדים לצמצום משמעותי. בנוסף, HEVNPs בעלי תחום בליטה חשוף שטח (תחום P) מחובר באמצעות ציר גמיש כדי icosahedral בסיס יציב. התחום P צורות השטח החשופים קוצים על גבי הבסיס icosahedral בזמן הציר גמישה מאפשרת לך לשנות באופן משמעותי את התחום P מבלי להתפשר על מבנה icosahedral בסיס. עם 60 יחידות חוזרות ונשנות, שינוי בייעודי לאתר יחיד התוצאה 60 אתרים סימטרי עבור אפנון כימי. לאחרונה, הצענו ננו-פלטפורמה באמצעות HEVNP זה יכול מבחינה כימית נזווג ליגנדים או מולקולות קטנות עבור יישומים theranostic. זה הושג על-ידי החלפת חומצה אמינית בודדת של ציסטאין על תחום בליטה של HEV-הוי כאתר התגובה עם פפטידים מקושרים maleimide או מולקולות. בהתבסס על ניתוח מבנה הקודם של HEV-הוי ו-8,epitopes immunogenic למד היטב9, חומצות אמינו HEV-הוי חמש הבאה הוחלפו ציסטאין כמו מועמדים פוטנציאליים: Y485C, T489C, S533C, N573C ו- T586C ( איור 1). לאחר ביטוי וטיהור מתאי חרקים, תצורות האח מים שלהם שאושרו על-ידי שידור מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) תצפית (איור 2), ואת האתרים ציסטאין חשוף נותחו על ידי המערב כתם לאחר ביוטין מקושר-maleimide ההטיה (איור 2). בין המוטציות חמש, HEVNP – 573C את האות החזק ביותר של maleimide-ביוטין ההטיה (איור 2), מוצגים שימש להמשך להוכחה nanocarrier עבור תא סרטני השד מיקוד4 (איור 3).
פרוטוקול זה מתאר שיטות ההטיה כימי כדי לצרף פילוח הגידול מולקולות HEVNPs דרך משטח ציסטאין ההטיה. אנחנו פירוט את ההטיה של מולקולות מיקוד וזיהוי הגידול למסירה הגידול עם HEVNPs רקומביננטי המכיל של ציסטאין-N573 (HEVNP – 573C). אנחנו התמקדנו תהליך ההטיה דו-שלבי כימיה לחץ כדי לאגד גידול סרטן השד מיקוד פפטיד, LXY3010 כדי HEVNPs להיווצר LXY30-HEVNP (איור 4). לאחר מכן, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 היו מצומדת לאתר Lys נפרד HEVNPs לבנות LXY30-HEVNP-Cy5.5 לגילוי פלורסנט הן במבחנה (איור 5), ויוו4.
Protocol
Representative Results
Discussion
בניגוד ההליך זמן רב הנדסה גנטית, אשר בדרך כלל לוקח שבועות, כאן אנחנו להדגים שני שלבים פשוטים והליכי צעד אחד ההטיה כימי, אשר יכולה להסתיים בתוך 3 ימים, של הוספת הסרטן מיקוד ליגנד ו/או קרינה פלואורסצנטית צבע זיהוי לאתרים Cys/ליס של HEVNPs. ניתן להשתמש בטכניקה המסך עבור היעד ליגנד הטוב ביותר מתוך מא?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים לאשר חסות המימון כדי RHC על ידי NIH להעניק #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, המכון הלאומי מזון, חקלאות, כמו גם את התוכנית מן המניין פינלנד.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
Referenzen
- Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
- Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
- Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
- Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
- Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
- Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
- Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
- Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
- Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
- Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
- Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
- Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
- Technologies, N. b. L. . Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).
- Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).
