Здесь мы описываем протокол для иммунопреципитации chromatin о модифицированных гистонами от начинающего дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ДНК впоследствии используется для количественного PCR допросить изобилия и локализации столб-поступательные изменения гистона на протяжении всего генома.
Столб-поступательные изменения гистона (PTMs), такие как ацетилирования, метилирование и фосфорилирования, динамически регулируется ряд ферментов, которые добавить или удалить эти знаки в ответ на сигналы, полученные в ячейке. Эти PTMS являются важнейшими действующими лицами для регулирования процессов таких как выражение гена управления и ремонта ДНК. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) был инструментальный подход для рассечения изобилия и локализации многих гистона PTMs на протяжении всего генома в ответ на разнообразные возмущений в ячейку. Здесь описан универсальный способ выполнения чип post-translationally модифицированных гистонами от начинающего дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Этот метод полагается на сшивки белков и ДНК, используя формальдегида лечения дрожжевых культур, поколение лизатов дрожжей, бисера, избиение, солюбилизация фрагментов хроматина, Микрококковая Нуклеаза и иммунопреципитации гистон-ДНК комплексы. ДНК, связанные с гистонов Марк интерес очищается и подвергается количественной ПЦР-анализа для оценки ее обогащения на нескольких локусов на протяжении всего генома. Представитель эксперименты зондирующего локализация меток гистона H3K4me2 и H4K16ac в wildtype и мутанта дрожжей обсуждаются продемонстрировать анализа и интерпретации данных. Этот метод подходит для различных гистона PTMs и может выполняться с различными мутантных штаммов или в присутствии различных экологических подчеркивает, что делает его отличным инструментом для изучения изменений в динамике хроматина в различных условиях.
Динамического столб-поступательные изменения гистонов (ПТМ) является ключевым механизмом регулирования для многих ДНК шаблонного процессов, в том числе транскрипции и репликации ДНК ремонт1,2. Возможность определить изобилие и точной локализации модифицированных гистонами сочетанной с этими процессами таким образом имеет решающее значение для понимания их регулирования в различных условиях в ячейке. Развитие иммунопреципитации chromatin (обломока) как метод, во многом обусловлены биохимических исследований взаимодействия белков с ДНК, особенно в vitro методы с использованием химических сшиватели, наряду с необходимостью оценки Динамическая природа ДНК белковых взаимодействий в естественных условиях и в отдельных регионах генома3,4,5. Улучшения количественного PCR (ПЦР) и технологий виртуализации также расширил возможность выполнения чип эксперименты с количественных сопоставлениях и через весь геном, что делает его мощным инструментом для рассечения ДНК белковых взаимодействий на несколько уровней.
В настоящее время чип является необходимый метод для любой исследовательской группы заинтересованы в хроматина опосредованное регулирование генома, как есть без сопоставимых методов непосредственно допроса физической связи между изменение гистона и конкретных геномной Локус в VIVO. Хотя имеются вариации этого метода, с помощью следующего поколения последовательности для сопоставления изменения гистона на протяжении всего генома6,7 , эти подходы могут обращаться различные научные вопросы и их масштаба, стоимость и технические ресурсы могут ограничения для некоторых исследовательских групп. Кроме того, целевые чип ПЦР необходимых для дополнения этих подходов, предоставляя методы как оптимизировать чип протокола до начала последовательности и проверить результаты от epigenomic наборов данных. Масс-спектрометрия основанные подходы для выявления бессепараторные гистонов, марки, связанные с геномной регионы имеют также появились8,9,10,11, однако, эти подходы имеют некоторые ограничения относительно того, какие регионы генома может быть исследован и они требуют технических знаний и инструментария, которые не будут доступны для всех исследовательских групп. Таким образом чип остается основополагающий метод для анализа изобилия и распределение изменения гистона при различных условиях для всех исследовательских групп, заинтересованных в эпигенетики, хроматина и регулирование геномной функций.
Здесь мы описываем метод чип с использованием дрожжей начинающих модель Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) для изучения распределения гистона PTMs на хроматина. Этот подход основывается на ряде ключевых компонентов чип протоколов, разработанных в дрожжей и применяется также к разнообразной модели систем12,13. Взаимодействие между ДНК в клетке и модифицированных гистонами сохраняются сшивки с формальдегидом. После lysate подготовки хроматина фрагменты являются солюбилизирован в равномерно размера фрагментов, пищеварение с Микрококковая нуклеиназы. Иммунопреципитация модифицированных гистонами выполняется с коммерческой или генерируемые лаборатории антител и любые связанные ДНК изолирована и проанализированы для обогащения в конкретных регионах геномной, с помощью ПЦР (рис. 1). Для многих гистона модификаций количество ДНК, полученных из настоящего Протокола является достаточным для тестирования более чем 25 различных локусов генома, ПЦР.
Этот метод чип универсальный для контроля за распределением одного гистона модификации нескольких мутантных штаммов или условий окружающей среды, или для тестирования нескольких изменения гистона wildtype клеток на количество локусов генома. Кроме того многочисленные компоненты протокола легко регулируемая оптимизировать обнаружение либо высоко – или смирен обильные меток гистона. Наконец выполняя чип модифицированных гистонов в многообещающий дрожжей обеспечивает возможность использования ключевых элементов для специфичность антитела, которые в основном недоступны в других системах. А именно, штаммов дрожжей могут быть созданы, которые носят точечные мутации в гистона остатков, которые предназначены для изменения, и, в некоторых случаях, есть только один фермент, который катализирует модификации на конкретной гистона остатков (например. лизин гистона methyltransferases). Таким образом чип может выполняться либо гистона мутанта или фермента удаления штаммов для анализа степени неспецифической Связывание антитела могут происходящих и генерации ложных положительных результатов. Этот элемент управления является особенно ценным для разработанной антител и даже могут быть использованы для проверки специфичность антитела для изменения гистона сохраняется до их использования в других системах. Этот подход дополняет другие методы для тестирования специфичность антитела, которые отличают между государствами различных изменений (таких как моно-, ди – и tri метилирование), включая зондирующего массивы модифицированных пептидов и выполнение западных помарках гистонами или нуклеосом с определенными изменениями. В целом чип в многообещающий дрожжей является мощный метод для оценки динамики гистона PTMs на протяжении всего генома и пройдя через механизмы, регулирующие их регулирования.
Процедура, описанная здесь позволяет для эффективного восстановления ДНК, связанные с гистонами изменение в клетках дрожжей по иммунопреципитации. Это сопровождается ПЦР с праймерами, которые усиливают областей, представляющих интерес для определения местных обогащения или истощен?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить членов зеленый лаборатории для полезной дискуссии. Эта работа частично поддержали NIH грантов R03AG052018 и R01GM124342 для E.M.G.
Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
Tris | Amresco | 0497-5KG | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
α H3 | Abcam | ab1791 | |
α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |