Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定
Summary
衛星細胞の正確な同定は様々 な生理学的、病理学的条件の下でその機能を研究するために不可欠です。この記事では、蛍光抗体法による染色による大人の骨格筋のセクションの衛星細胞を識別するためにプロトコルを示します。
Abstract
蛍光抗体法は、異なる細胞ティッシュ セクションの種類を識別するため効果的な方法です。目的のセル人口を研究するために特定のセル マーカーの抗体はティッシュ セクションに適用されます。大人の骨格筋衛星細胞 (SCs)、筋肉の修復と再生に貢献する幹細胞です。したがって、視覚化し、異なる生理学的な条件の下で衛星細胞集団を追跡することが重要です。安静時骨格筋の SCs は基底膜と筋線維膜の間に存在します。筋線維、細胞培養、SCs を識別するために一般的に使用されるマーカーは、ペアになっているボックス タンパク質 Pax7 です。この記事では、非特定の染色と背景を最小限に抑える骨格筋のセクションに最適化された Pax7 蛍光プロトコルが表示されます。基底膜のタンパク質 (ラミニン) を認識する別の抗体はまた SCs 同じようなプロトコルを識別するのに役立つダブルまたはトリプル Pax7 興味の他の蛋白質のための抗体とラベル付けを実行するも使用ことができますを追加しました。
Introduction
骨格筋は多核巨細胞の筋肉細胞から成るであると呼ばれる、力および収縮運動を生成する筋線維で構成されています。いくつかの顔面の筋肉を除いて、最も骨格筋は、体節1と呼ばれる一時的な萌芽期の構造から派生します。筋芽細胞になる上皮体節から筋前駆細胞が剥離されます。さらに筋芽細胞は多核筋線維を形成する細胞になる融合細胞に分化します。上記のプロセス筋形成と遺伝子発現の制御を一時的に規制されているが特徴です。筋原性前駆体は筋芽細胞表現 MyoD および/または Myf5 と心筋細胞表現する myogenin とミオシンの2,3に対し Pax3 と Pax7 を表現します。筋肉の成長は、既存のファイバー (過形成) により筋核を組み込むことによって、筋線維 (肥大) のサイズ4の増加によってに筋線維が大きくなるプロセスです。筋肉の成長の間に、彼らは区別し、自己更新できる幹細胞プロパティを持つ筋細胞の持続可能なソースです。これらの細胞は筋鞘 (筋線維の細胞膜) と基底膜5の間の物理的な場所に基づく衛星細胞と呼ばれます。SCs は、精力的に幼若期 (生後マウスの最初の 2-3 週間) 筋肉の成長に貢献するが、大人の筋6を安静時の休止状態になります。驚くことに、筋肉への応答で再アクティブ化できます傷つけるし、7損傷した筋肉を修復する新しい筋肉細胞に分化します。
茎セルのプロパティは、基本的な筋生物学、筋疾患8の治療に関連する SCs の研究を行います。その結果、過去数十年で強烈な調査の領域だった。途方もない進歩は、遺伝学および SCs9,10のエピジェネティクスを切り裂くことにしました。分離するとその場でSCs を識別する技術を開発し、11の方法に沿って最適化します。免疫蛍光染色は、Pax7 を含む特定の抗体を使用して SCs を識別できます。しかし、希少性と大人の骨格筋組織の強い自己蛍光と組み合わせて SCs の小型レンダリング視覚化挑戦。ここでは、蛍光染色プロトコル Pax7 のマウスの筋肉組織の最適化し、ゼブラフィッシュ筋12既存法に基づくについて述べる。さらに、SCs が下である基底膜を識別するために異なる蛍光ラベルの付いたラミニン抗体を採用します。このプロトコルは、一貫して Pax7 正 SCs と発達段階とすべてのテストの生理学的な条件の下で筋前駆体の可視化をできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のプロトコルは、ゼブラフィッシュ骨格筋12Pax7/MF20 染色法に基づいていた。ソリューションの使用手順をブロックが同じまたは類似しました。使用抗体は同一です。調整手順は、マウスの筋肉組織と SCs の機能に基づいていた。まず、ラミニン抗体は、視覚化し、SCs の位置を確認するためにミックスに追加されました。それは 488/555; のデュアル フィルター キューブを?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIAMS 光イメージング セクション顕微鏡と技術的なサポートを提供するために感謝いたします。MF20 Pax7 抗体は、発育の後援の下で開発され、アイオワの大学、生物科学専攻、アイオワ シティで維持発達研究ハイブリドーマの銀行から得られました。この作品は、国立衛生研究所の NIAMS の学内研究プログラムによって支えられました。
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
Referenzen
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