Культура человека плюрипотентных стволовых клеток на поливинилового спирта Co Итаконовая кислоты гидрогели с различной жесткости Xeno свободных условиях
Summary
Протокол представлен подготовить поливинилового спирта co Итаконовая кислоты гидрогели с различной жесткости, которые были привиты с и без Олигопептиды, исследовать эффект жесткости биоматериалов на дифференциацию и распространение Стволовые клетки. Жесткость гидрогели контролировался сшивки времени.
Abstract
Исследовано влияние физических сигналов, таких как жесткость биоматериалов на распространение и дифференцирования стволовых клеток, несколько исследователей. Однако большинство этих исследователей использовали Полиакриламидные гидрогели для стволовых клеток культуры в их исследованиях. Таким образом их результаты неоднозначны, поскольку эти результаты могут исходить от конкретных характеристик полиакриламида, а не из физической cue (жесткость) биоматериалов. Здесь мы описываем протокол для подготовки гидрогели, которые не основаны на полиакриламида, где различные стволовых клеток, включая клетки человеческих эмбриональных стволовых (ES) и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, может быть культивировали. Гидрогели с различной жесткости были подготовлены биоинертный поливинилового спирта co Итаконовая кислоты (P-IA), с жесткостью, контролируется степень сшивки, изменяя время сшивки. P-IA гидрогели, привитый с и без Олигопептиды, производный от внеклеточного матрикса были исследованы как будущей платформы для стволовых клеток культуры и дифференциации. Культура и прохождение амниотической жидкости стволовых клеток, жировой производные стволовых клеток, клеток человека ES и клетки человека iPS это подробно описано здесь. Пальмитоила P-IA гидрогели показали Улучшенный спектакли, которые были вызваны их свойства жесткости. Этот протокол сообщает синтез биоматериала, их поверхности манипуляции, а также контролировать жесткость свойства и, наконец, их влияние на судьбу стволовых клеток с использованием условий xeno свободной культуры. Основываясь на последних исследованиях, такое изменение подложки могут выступать в качестве будущих платформ поддержки и направлять судьбу различных стволовых клеток линии для различных связей; и далее, регенерации и восстановления функции утраченных органа или ткани.
Introduction
Судьба дифференцировку стволовых клеток в конкретной линии клеток и долгосрочного распространения стволовых клеток, особенно человеческое индуцированных плюрипотентных (iPS) клетки и клетки человеческих эмбриональных стволовых (ES), как известно, регулироваться ингибиторы, факторы роста, и / или мелких биоактивных молекул в культуре средств массовой информации. Недавно физические сигналы биоматериалов, особенно жесткость биоматериалов культуры клеток, были признаны важным фактором руководящих судьба клеточной пролиферации и дифференцировки1,2, 3,4,5,6. Таким образом некоторые исследователи начали расследовать судьбу стволовых клеток, которые выращиваются на гидрогели, на дифференциации, главным образом с помощью Полиакриламидные гидрогели с разной жесткости.
Жесткость биоматериалов могут управлять фокуса спайки, морфологию клеток, клеток фенотипа и адгезии стволовых клеток, особенно в двумерные (2-D) выращивания1,2,3,5. Механо зондирования биоматериалов, стволовые клетки обычно контролируется фокуса адгезии сигнализации через Интегрин рецепторов. NMMIIA, nonmuscle миозин МИС зависимых сократительную способность Цитоскелет актина играет решающую роль в процессе mechanosensing стволовых клеток в клетки 2-D культивирования систем3,4,5, 7,8,9,10,11.
Энглер и его коллеги разработали интересный понятие, что взрослые стволовые клетки, таких как клетки костного стволовых (BMS), культивируемых на культуры клеток биоматериалов с аналогичными жесткость, конкретных тканей, склонны дифференцироваться в клетки, происходит от конкретные ткани5. BMS клетки инкубировали на 2-D мягкой Полиакриламидные гидрогели, покрытые коллаген типа I (с жесткость сравнима с тканей мозга) в расширении СМИ спонтанно склоняли дифференцироваться в начале нейрон линий, в то время как БМС клетки культивировали на гидрогели с жесткостью, похож на мышцы или коллагеновых костных тканей были найдены побудить дифференцировке в начале миоцитов и остеобластов, соответственно, на 2-D Полиакриламидные гидрогели3,5. Многие исследователи провели расследование судьбы дифференцировки стволовых клеток культивированный на Полиакриламидные гидрогели, прикол с коллагеном типа12,13,14,,1516 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Однако, следует отметить, что некоторые противоречивые доклады1,18,22,,2324 существуют хорошо известные идеи, предложенные Энглер и др. 5 это потому что Энглер идея5 была разработана исключительно на Полиакриламидные гидрогели и их результаты, возникла из специфических характеристик биоматериала (Полиакриламид), а не только от физической кий (жесткость) биоматериал. Таким образом важно разработать другой тип гидрогеля, из которых жесткость может управляться сшивки гидрогелей. Для этой цели были разработаны биоинертный гидрогели, которые были подготовлены из поливинилового спирта co Итаконовая кислоты (P-IA) с различными жесткость, который контролировался степени сшивки с меняющейся сшивки время25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. Стволовые клетки можно выращивать на nonmodified P-IA гидрогели, а также P-IA гидрогели, привитый с внеклеточной матрицы (ECMs) и олигопептиды. В предыдущем исследовании25гемопоэтических стволовых клеток человека (hHSCs) из пуповинной крови выращивали на P-IA гидрогели с различными жесткость значения от 3 кПа до 30 кПа модуль хранения где фибронектин или пальмитоила, производный от P-IA гидрогели был привитым фибронектина (CS1, EILDVPST). Высокая ex vivo раз расширение hHSCs наблюдалось в P-IA гидрогели, привитый с CS1 или фибронектин, которого отображаются промежуточные жесткость, начиная от 12 кПа до 30 кПа25.
Человека iPS и клетки ES не может культивироваться на обычных культуры ткани из полистирола (TCP) блюда33,34 потому что человека ES и ИПК клетки требуют конкретной привязки к ECMs, например vitronectin или Ламинин поддерживать их плюрипотентности в ходе долгосрочного культуры. Таким образом несколько структур пальмитоила привитые P-IA гидрогелей с оптимальной жесткости характеристиками были разработаны и подготовлен в формирования единой цепи, единую цепь с совместного сегмента, двойная цепь с совместного сегмента и типа разветвленных цепь32. Пальмитоила последовательности были отобраны из Интегрин и Глюкозаминогликан связывания доменов ECMs. P-IA гидрогели, привитый с vitronectin производные Олигопептиды с двойной цепи или совместного сегмента, которые имеют модуль хранения примерно 25 кПа, поддерживает долгосрочные культуры человека ES и ИПК клетки для более чем 12 отрывков под xeno свободно и химических определенных условиях32. Совместный сегмент и двойной цепи с молекулы адгезии клеток на гидрогели способствовали распространению и плюрипотентности человека ES и iPS клетки32. Здесь протокол для подготовки P-IA гидрогели (с хранения модуль из 10 кПа до 30 кПа, который измерялся в влажных условиях в воздухе) привиты с и без Олигопептиды или ECMs описан. Показано, как культура и проход несколько стволовых клеток (включая амниотической жидкости стволовые клетки, жировой, полученных стволовые клетки, человеческие клетки ES и клетки человека iPS).
Protocol
Representative Results
Discussion
P-IA-oligoECM и гидрогели P-IA-ECM с различной жесткости были разработаны для долгосрочного расширения человеческих ES и клетки iPS, поддержание их плюрипотентности более десяти проходов в xeno свободных условиях, а также для культуры клеток человека АСПО, объявления клетки, и гемопоэтических ствол…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Частично это исследование было поддержано Министерством науки и технологии, Тайвань под номера грантов-003 106-2119-M-008, 105-2119-M-008-006 и 104-2221-E-008-107-MY3. Это исследование также поддержали проект строительства больницы Landseed Тайвань (НКГ-LSH-105-A-001). Целевые субсидии для проведения научных исследований (номер 15K 06591) от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии также признал. A. Хигути хотели бы признать для вице ректорате международного научного партнерства (ISPP-0062) для обучения и научных исследований, Университет короля Сауда, Эр-Рияд 11451, Королевство Саудовской Аравии.
Materials
| GTPGPQGIAGQRGVV | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD |
| GACRGDCLGA | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: FN1 |
| KGGAVTGRGDSPASS | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: CS1 |
| EILDVPST | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1 |
| KGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP1 |
| GKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: HBP2C |
| CGGGKKQRFRHRNRKG | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN1G |
| GGGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Oligopeptide Abbreviation: VN2C |
| GCGGKGGPQVTRGDVFTMP | PH Japan | none | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: rVN |
| Vitronectin | Thermo Fisher scientific | A14700 | Specification: Extracellular matrix Abbreviation: FN |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Specification: Commercially available coating material Abbreviation: Synthemax II |
| Synthemax II | Corning | 3535 | Specification: Polymer |
| Polyvinylalcohol-co-itaconic acid | Japan VAM & Poval | AF-17 | Specification: Chemical |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | Specification: Chemical |
| Na2SO4 | Sigma-Aldrich | 239313 | Specification: Chemical |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | Specification: Chemical Abbreviation: EDC |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E7750 | Specification: Chemical Abbreviation: NHS |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 56480 | Specification: Chemical |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Specification: Chemical |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Specification: Cell culture consumable |
| Cell scraper | Corning | 3008 | Specification: Cell culture consumable |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | SI-D4693 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 6 | Thermo Fisher scientific | A1516401 | Specification: Cell culture medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher scientific | A1517001 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher scientific | 11330-032 | Specification: Cell culture medium |
| DMEM | Thermo Fisher scientific | 12800-017 | Specification: Cell culture medium |
| MCDB 201 | Sigma-Aldrich | M6770 | Specification: ES cell |
| Human ES cell | WiCell Research Institute, Inc.. | WA09 | Specification: iPS cell |
| Human iPS cell | Riken Cell Bank | HS0077 | Specification: 35 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353001 | Specification: 60 mm Abbreviation: TCP |
| TCP dish | Corning | 353002 | Specification: 24 well dish |
| 24 well dish | Corning | 353047 | Specification: Blocking agent |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | Specification: Detection reagent |
| Alkaline phosphatase live stain | Thermo Fisher scientific | A14353 | Specification: Detection reagent |
| Hematoxylin & eosin | Sigma-Aldrich | 1.05175 | Specification: EB formation dish |
| 6-well ultralow attachment dish | Corning | 3471 | Specification: Coating material |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Specification: Coating material |
| Matrigel | Corning | 354230 | Specification: Mice |
| NOD-SCID mice | National Applied Research Laboratories | None | Specification: Serum |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1A | Specification: Antibiotic |
| antimycotic antibiotic | Thermo Fisher scientific | 15240-062 | Specification: Antibody |
| Antibody for Nanog | Invitrogen | MA1-017 | Specification: Antibody |
| Antibody for SSEA4 | Abcam | ab16287 | Specification: Antibody |
| Antibody for OCT3/4 | Invitrogen | PA5-27438 | Specification: Antibody |
| Antibody for Sox2 | Invitrogen | 48-1400 | Specification: Antibody |
| Antibody for Smooth Muscle Actin | Invitrogen | PA5-19465 | Specification: Antibody |
| Antibody for AFP | Invitrogen | PA5-21004 | Specification: Antibody |
| Antibody GFAP | Invitrogen | MA5-15086 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A-21422 | Specification: Antibody |
| Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody | Invitrogen | A-11008 | Specification: Antibody |
Referenzen
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
- Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
- Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
- Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
- Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
- Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
- Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
- Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
- Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
- Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
- Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
- Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
- Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
- Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
- Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
- Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
- Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
- Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
- Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
- Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
- Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
- Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
- Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
- Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
- Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
- Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).
