Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Summary

Hier verwenden wir zweidimensionale Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese bestätigen das Vorhandensein von Amyloid-wie Fasern von heterogenen Größe und die Möglichkeit, die die Größe Heterogenität durch Dissoziation der Amyloid Fasern während des Gels ist ausgeschlossen laufenden Prozess.

Abstract

Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern wurden mit vielen menschlichen Krankheiten und sind jetzt wichtig für viele Signalwege entdeckt. Die Fähigkeit, die Bildung dieser Fasern unter verschiedenen experimentellen Bedingungen leicht zu erkennen ist wichtig für das Verständnis ihrer potenzialfunktion. Viele Methoden wurden verwendet, um die Fasern zu erkennen, aber nicht ohne einige Nachteile. Elektronenmikroskopie (EM) oder Färbung mit Kongo-rot oder Thioflavin T oft erfordert z. B. Reinigung der Fasern. Auf der anderen Seite ermöglicht Waschmittel Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese (SDD-Alter) Erkennung der SDS-resistente Amyloid-ähnliche Fasern in zellextrakte ohne Reinigung. Darüber hinaus ermöglicht es den Vergleich der Größenunterschied der Fasern. Noch wichtiger ist, kann verwendet werden, um bestimmte Proteine innerhalb der Fasern durch westliche Beflecken zu identifizieren. Es ist weniger zeitaufwändig und leichter zugänglich, eine größere Zahl von Labs. SDD-Alter Ergebnisse zeigen oft Variablen Grad der Heterogenität. Es stellt sich die Frage ob die Dissoziation der Proteinkomplex während der Elektrophorese in Anwesenheit von SDS Bestandteil der Heterogenität entsteht. Aus diesem Grund haben wir eine zweite Dimension der SDD-alt sein, um festzustellen, ob die Größe Heterogenität in SDD-Alter gesehen wirklich ein Ergebnis der Faser Heterogenität in Vivo und kein Ergebnis einer Verschlechterung oder Dissoziation von einige der Proteine während beschäftigt Elektrophorese. Diese Methode ermöglicht schnelle und qualitative Bestätigung, das Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nicht teilweise während des Prozesses der SDD-Alter entkoppelt sind.

Introduction

Die Bildung von Amyloid Fasern durch Protein misfolding ist seit langem bekannt in pathologischen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Huntington-Krankheit¹eine Rolle spielen. In jüngerer Zeit, die Bildung von Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nachweislich die Signalwege bei Menschen, auch während der Anti-virale angeborene Immune Antwort² und Necroptosis^3,4, und bei niederen Organismen gehören z. B. Hefe^5,6. Daher ist die Fähigkeit, diese Fasern im Labor erkennen wichtig. Derzeit gibt es drei Arten Amyloid und Amyloid-wie Fasern zu erkennen: die Verwendung von Farbstoffen, EM und SDD-Alter.

Die Verwendung von Farbstoffen, z. B. Kongo-rot oder Thioflavin T, bietet den Vorteil, schnell und leicht nachweisbar mit Mikroskopie oder Spektroskopie⁷. Erkennung von Mikroskopie, im Falle von Kongo-rot, bietet jedoch keine Besonderheit, welche Proteine die Fasern oder die Größe der Fasern bestehen. Ebenso bietet die Verwendung der Spektroskopie, Kongo-rot oder Thioflavin T Bindung an Proteinkomplexe erkennen nur ein positives oder negatives Ergebnis.

EM bietet schlüssige Beweise für die Anwesenheit von Fasern und auch quantitative Informationen über die Faser Länge und Durchmesser⁸. Diese Methode erfordert jedoch sehr strenge Reinigung. Darüber hinaus ist EM eine spezielle Technik, die teure Ausrüstung verwendet.

SDD-AGE wurde zur SDS-resistente Mega Dalton Proteinkomplexe einschließlich amyloide oder Amyloid-wie Fasern zu erkennen. Es bietet viele Vorteile. Erstens, es erfordert nicht die Reinigung der Fasern und ist leicht zu Peform⁹. Zweitens bietet es qualitative Informationen über die Größe der Fasern, einschließlich der relativen Größe und Menge der Faser Heterogenicity. Schließlich, weil westliche Beflecken nach Elektrophorese durchgeführt werden kann, ist es einfach, das Vorhandensein von jedem, das Protein für die ist ein Antikörper erkennen, obwohl anzumerken ist, dass da SDD-Alter Semi-denaturierenden ist, einige Epitope verdeckt die verbleiben können Erkennung erschwert von Antikörpern.

Vor kurzem, Rezeptor Interaktion Proteinkinase 1 (RIPK1) und 3 (RIPK3) gemeldet wurden, Form Amyloid Fasern dienen als Signalisierung Plattformen während der Necroptosis, eine programmierte Form der Nekrose³. Während des Studiums diese Fasern, zeigte unserem Labor, dass ein anderes Necroptosis-assoziierten Protein, gemischte Abstammung Kinase-Domäne-wie (MLKL), auch Amyloid-wie Fasern⁴gebildet. Allerdings erschien bei Betrachtung mit dem SDD-Alter, die Größe der MLKL Fasern unterscheidet sich von der RIPK1 und RIPK3 Fasern, die identisch zueinander (Abbildung 1) erschienen. Das war unerwartet, da es bekannt ist, dass MLKL an RIPK1/RIPK3 bindet bilden die Necroptosis Signalisierung Komplex namens Necrosome¹⁰.

Es gibt mindestens zwei Erklärungen. Zunächst zwei völlig unterschiedliche Amyloid-wie Fasern können während der Necroptosis, ein mit RIPK1/RIPK3 und die andere mit MLKL bilden. Zweitens ist nur eine Art von Amyloid-wie Fasern, die mit RIPK1/RIPK3/MLKL bei Necroptosis, sondern die Vereinigung des MLKL mit anderen Proteinen entstehen kann schwach genug, die es während der SDD-Alter distanziert.

Um dieses Problem anzugehen, schlagen wir eine zweidimensionale (2D) SDD-Alter durchführen. SDD-Alter-Stable Amyloid oder Amyloid-wie Fasern haben das gleiche Migration Muster während der ersten und zweiten Dimension Elektrophorese. Dies wird nach der Proteine auf eine Membran übertragen und ein Western-Blot nachweisbar sein. Stabilere Fasern zeigen eine scharfe Muster mit diagonalen Streifen. Jede Abweichung von diesem würde vorschlagen, dass die Fasern durch die SDS-Elektrophorese verändern.

Protocol

1. Proben vorbereiten Kultur 2 x 106 Amyloid Herstellung von HT-29 Darmkrebszellen in einer Gewebekultur 10 cm Schale in 10 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum und Penicillin-Streptomycin. Zellkulturen über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2. Nachdem die Zellen zu 80 % Konfluenz wachsen, Waschen der Zellen mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). 3 mL Trypsin-Lösung hinzugeben und bei 37 ° C für 3 min inkubieren…

Representative Results

Nach Necroptosis Induktion zeigten RIPK1 und RIPK3 fast identische Amyloid-Mustern (Bahnen 2 und 4, Abbildung 1). Jedoch MLKL Fasern wurden heterogener und schien kleiner als RIPK1/RIPK3 Fasern (Bahn 6, Abbildung 1). Das veranlasste uns, die 2D SDD-Alter-Methode, um die Möglichkeit zu befassen, ob MLKL RIPK1/RIPK3-unabhängige Fasern bildet oder MLKL einfach distanziert sich von den großen RIPK1/RIPK3/MLKL-Fasern während SDD-A…

Discussion

Der wichtigste Aspekt des 2D SDD-Zeitalters ist, dass die Elektrophorese-Bedingungen für die erste und zweite Dimension gleich sind. Die Fähigkeit zu erkennen, eine scharfe diagonale Linie auf 45° (d. h., die keine Dissoziation oder Verschlechterung eingetreten ist) hängt von der Fasern, die Migration in identischer Weise sowohl bei electrophoreses. Mit unterschiedlichen Bedingungen, zum Beispiel indem die Spannung oder die Länge der Laufzeit, werden diese Ergebnisse verdecken. Auch, wie bei traditionellen 1D der Fa…

Materials

gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L