인간에서 퇴행 성 Tenocyte를 취득 하는 프로토콜

Summary

Tendinopathy에 새로운 치료의 효능을 조사할 때 퇴행 성 tenocytes의 생체 외에서 사용은 필수적입니다. 그러나, 대부분의 연구 연구 동물 모델 또는 건강 한 tenocyte를 사용합니다. 우리는 수술 하는 동안 인간의 퇴행 성 tenocytes를 분리 하는 다음 프로토콜을 제안 합니다.

Abstract

증가 신체 활동 및 더 긴 수명으로 인해 선진국에서 증가 Tendinopathy, 힘 줄 변성에 대 한 응답에서을 개발 하 고 고통 스러운 상태 이다. 그것의 증가 보급에도 불구 하 고 기본 병 인 아직도 불분명 하 게, 남아 있다 그리고 치료는 일반적으로 증상을 보인다. 최근, 성장 인자, 줄기 세포 및 유전자 치료 등 다양 한 치료 옵션은 퇴행 성 힘 줄의 치료 효능을 향상을 위해 조사 되었다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 동물 모델 또는 건강 한 인간 tenocytes에만 실시 되었다. 병 적인 tenocytes를 사용 하 여 일부 연구에도 불구 하 고 우리의 지식 최선을 다 해 현재는 인간의 퇴행 성 tenocytes을 구하는 방법을 설명 하는 아무 프로토콜. 이 연구의 목적은 인간의 퇴행 성 tenocytes 획득을 위한 표준 프로토콜을 설명 하는 것입니다. 처음에, 힘 줄 조직은 수술 하는 동안 측면 염증 환자에서 수확 했다. 다음 생 샘플 해당 수술 시 관찰 하는 구조적인 변화 하 신 근 피 radialis brevis 힘에서 촬영 됐다. 수확된 힘 줄의 모든 지루한, 회색, 어렵다면, 등장 하 고, edematous는 그들이 만든 건강 한 사람에서 시각적으로 뚜렷한. Tenocytes 배양 하 고 실험을 위해 사용 했다. 한편, 수확 조직의 절반 조직학, 분석 되었다 그리고 tendinopathy angiofibroblastic 형성 (증식) 같은 주요 기능을 공유 하는 그들은 보였다. Immunocytochemistry에 의해 2 차 분석 확인 배양된 세포 모호크와 tenomodulin 단백질에 대 한 긍정적인 얼룩을 갖는 셀의 대다수와 가진 tenocytes 했다. Tenocytes의 퇴행 성 자연의 자질 다음 확산 분석 결과 또는 qRT-PCR를 사용 하 여 건강 한 컨트롤 셀 비교 하 여 결정 했다. 퇴행 성 tenocyte 더 높은 확산 속도 일치 하는 이전 보고서 tendinopathy의 유사한 유전자 표현 패턴 표시. 전반적으로,이 새로운 프로토콜 tendinopathy의 미래 연구에 대 한 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.

Introduction

Tendinopathy 신체의 다양 한 부분에서 개발 하 고 만성 퇴행 성 근 골격 계 상태 이다. 최근, tendinopathy의 케이스의 수에 참여 레크리에이션 스포츠 및 증가 평균 수명^1,2성장으로 인해 선진국에서 크게 증가 했다. Tendinopathy의 원인 multifactorial 간주 됩니다 및 이러한 원인은 허 혈, 산소 자유 래 디 칼 부상, vasoconstrictor 및 vasodilator innervations, 내부 마이크로-눈물, 그리고 신경 레 귤 레이 션^{3에 변화 사이의 불균형 포함 ,,45,6,,78}. Tendinopathy에 대 한 대부분의 치료만의 증상을 완화. 또한, 조직 재생 없이 치료 재활에 대 한 오랜 시간을 요구 하 고 의사⁹임상 과제 부과 부상된 힘 줄에서 제한 된 응답 달성.

현재 치료 옵션과 자체에 퇴행 성 힘 줄의 능력의 부족의 무는 대체 치료 전략을 탐구에 관심을 가져 리드 연구원. 최근, 성장 인자를 사용 하 여 tendinopathy 힘 줄의 치료 효능을 향상을 위한 많은 유망한 결과 보고 하는 새로운 연구, 줄기 세포 기반 치료, 그리고 유전자 치료^10,,1112.

문학 검토를 통해 우리는 관련 된 연구의 분석 자료를 기반으로 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다 발견: 쥐, 마우스, 또는 토끼; 같은 동물 모델 그리고 인간의 모델입니다. 동물 모델에 관해서는 현재 두 개의 인기 있는 기술이 있다 tendinopathy 생성 하: 부상 또는 모델을 오버 로드 하는 기계 화학 유도. 그러나, 각 동물 모델은 복잡 한 인간의 tendinopathy 병리학^13,14재현에 제한 되었다.

대부분 논문 인간의 샘플을 사용 하 여 조직학 분석 했다 또는는 생체 외에서 퇴행 성 tenocyte^15,16,,1718 대신 건강 한 인간의 tenocyte를 기반으로 하는 실험 ^{, 19 , 20 , 21}. 몇 논문만 보고 그들이 인간의 퇴행 성 tenocyte를 사용 하지만 그들은 않았다 하지 자세히 설명 인간의^22,23에서 퇴행 성 tenocyte를 얻을 하는 데 사용 하는 프로토콜. 이러한 맥락에서 그것은 지적 되어야 인간의 효능 또는 효과 먹이 지 힘 줄 변성은 복잡 한 과정 때문에 병 인은 동물 모델 또는 건강 한 조직/tenocyte에서 성공적인 결과 반드시 예측 하지 수는 아직도 완전히 이해.

그것은 기증자에 게 부작용을 유발 하지 않고 인간의 조직에서 퇴행 성 tenocyte을 얻기 위한 표준 프로토콜을 설명 하는 데 필요한. 이 문서는 인간의 퇴행 성 tenocyte를 취득 하는 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 유효성을 검사 하려면 수확된 조직 조직학 분석 되었다. 그런 다음, 교양된 셀 immunocytochemistry (ICC), 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR), 생존 능력 분석 결과 사용 하 여 퇴행 성 tenocyte로 확인 되었다.

Protocol

프로토콜은 헬싱키의 선언에 따라 실시 하 고 프로토콜 차 분당 병원 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 1. 퇴행 성 힘 줄 조직 수확은 환자에서 의료 기록을 신체 검사 결과 사용 하 여 측면 염증 진단: 측면 뼈; 가까이 단 근원 부드러움 손목 관절의 저항된 확장에 의해 갖는 고통. 다음 포함 기준을 사용 하 여: 18 세 이상; 최소 6 개월;에 대 한 측면 염증의 ?…

Representative Results

조직학 분석 공개 측면 염증에서 수확된 조직 tendinopathic 힘 줄의 특성을 했다. H & E 섹션 tendinopathy 퇴행 성 힘 줄의 극성 및 좋은 직선, 강하게 포장 병렬 섬유 구조 손실 무질서 콜라겐 번들을 밝혔다. 조직학 징후 높은 cellularity 등 전형적인 스핀 들 모양 없이 확대 핵 변성의 암시 샘플에서 일반적 이었다. 또한, 퇴 화 한 힘 줄의 콜라겐 번들 상대적으로 약한 오신 H & E 스?…

Discussion

이전 연구의 숫자는 콜라 또는 kartogenin 주입, 실행, 디딜 방 아 등 더 많은^26,27다른 절차를 사용 하 여 만성 tendinopathic 동물 모델을 만드는 방법을 보고 있다. 수많은 연구가 동물 모델에 따라 유망한 치료 효과 보여, 비록 인간의 퇴행 성 tenocyte를 사용 하 여 실험 것입니다 중요 한 tendinopathy의 분야에서 치료의 효능을 재생 하기 위하여. 이 문서에서는, 우…

Materials

Scalpel	Kisanbio	KS-Q0306-15	No. 15
Mini-blade	Beaver	374769
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco	11995065
Collagenase Ⅱ	Sigma-Aldrich	C6885
PBS	Gibco	14190250
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000044
50 mM ascorbic acid-2-phosphate	Sigma-Aldrich	A5960
Antibiotic-Antimycotic solution	Gibco	15240062
4% formaldehyde	Bio-solution	BP031
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ml
BSA	Rdtech	C0082
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
MKX (C-5)	Santa cruz biotechnology	sc-515878
Tenomodulin (N-14)	Santa cruz biotechnology	sc-49325
Fluorescence Mounting Medium	DAKO	S3023
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306
WST-1	Dojindo Molecular Technologies	CK04
BrdU Cell Proliferation Assay Kit	Cell Signaling Technology	#6813
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	170-8891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Applied Biosystems	4369016
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02786624_g1
COL3A1	Thermo Fisher Scientific	Hs00943809_m1
ACTA2	Thermo Fisher Scientific	Hs00426835_g1
TAC1	Thermo Fisher Scientific	Hs00243225_m1
TACR1	Thermo Fisher Scientific	Hs00185530_m1
PTGS2	Thermo Fisher Scientific	Hs00153133_m1
ACTB	Thermo Fisher Scientific	Hs99999903_m1
Cell Strainers (100 µm)	Corning	352360
100mm culture dish	Thermo Fisher Scientific	8188207
8-well Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific	154534
96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3596
Nikon Eclipse 50i Microscope	Nikon
VERSA max microplate reader	Molecular Devices
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Paraffins	Leica Biosystems	3801340
Ethanol	JUNSEI CHEMICAL	90303-2185
Hematoxylin	DAKO	CS70030-2
Eosin	DAKO	CS70130-2
Alcian blue	DAKO	AR16011-2
Citric acid	Sigma-Aldrich	251275
Xylene	JUNSEI CHEMICAL	25165-0430
Endogenous peroxidases	DAKO	S200380-2
Canada balsam	JUNSEI CHEMICAL	23255-1210
Microtome Blade	FEATHER	A35
Slide glass	SUPERIOR	1000612
Cover glass	Marienfeld-Superior	101050
VEGF	Santa cruz biotechnology	sc-7269
SPSS Software	IBM		Ver. 18.0
Multi-purpose Centrifuge	LABOGENE	1248R