Identification de la Kinase cycline-dépendante 1 Sites de Phosphorylation spécifique par une Kinase In Vitro d’analyse
Summary
Kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) intervient dans la phase G2 du cycle cellulaire et régule les nombreuses voies cellulaires. Ici, nous présentons un protocole de test in vitro kinase Cdk1, qui permet l’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques pour l’établissement de cibles cellulaires de cette kinase importante.
Abstract
Kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) est un contrôleur maître du cycle cellulaire chez tous les eucaryotes et phosphoryle environ 8 à 13 % du protéome ; Toutefois, le nombre de cibles identifiées pour Cdk1, particulièrement dans les cellules humaines est encore faible. L’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique est importante, car elles donnent des indications mécanistes sur comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire. Régulation du cycle cellulaire est cruciale pour la ségrégation des chromosomes fidèle, et défauts dans ce complexe processus conduisent à des aberrations chromosomiques et le cancer.
Nous décrivons ici une analyse de kinase in vitro qui est utilisée pour identifier les sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques. Dans ce test, une protéine purifiée est phosphorylée in vitro par disponibles dans le commerce humain Successful Cdk1/cycline B. phosphorylation est confirmée par SDS-PAGE et sites de phosphorylation sont par la suite identifiés par spectrométrie de masse. Nous décrivons également les protocoles de purification qui donnent des préparations de protéines très pure et homogène qui conviennent à l’analyse de la kinase et un essai de liaison pour la vérification fonctionnelle des sites de phosphorylation identifiés, qui sonde l’interaction entre un signal de localisation nucléaire classique (cNLS) et son récepteur de transport nucléaire IMPORTINE α. Pour vous aider avec le plan expérimental, nous passons en revue les approches pour la prédiction des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique de séquences protéiques. Ces protocoles présentent ensemble une approche très puissante qui donne des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques et permet des études mécanistes dans Comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire. Étant donné que cette méthode s’appuie sur les protéines purifiées, il peut être appliqué à n’importe quel modèle organisme et rendements des résultats fiables, surtout lorsqu’il est combiné avec des études fonctionnelles cellulaire.
Introduction
Kinases sont des enzymes transfer groupements phosphate de l’ATP sur des substrats et de réguler les nombreux processus cellulaires. Cette phosphorylation est réversible, rapide, ajoute deux charges négatives et emmagasine l’énergie libre et est l’une des modifications post-traductionnelles couramment utilisées par les cellules. CDK1, qui est également connu sous le nom homologue de protéine 2 cycle de division cellulaire (cdc2) est un contrôleur maître du cycle cellulaire dans tous les eucaryotes1,2,3,4,5et phosphoryle une environ 8 à 13 % du protéome6,7.
Alors que les récentes études protéomiques ont identifié de nombreux sites de phosphorylation de protéines, dans la plupart des cas, la kinase responsable de ces modifications est inconnue. Le nombre de cibles Cdk1 connues, en particulier dans les cellules humaines est faible7. L’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique est importante, car elle permet des études mécanistes qui établissent comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire. Régulation du cycle cellulaire est importante pour la ségrégation des chromosomes fidèle et la division cellulaire, et une myriade de processus cellulaires doivent se produire à l’appui de cette importante fonction physiologique. Cela inclut les enrayer la transcription et la traduction avant le début de la mitose, ainsi qu’une réorganisation dramatique dans la structure cellulaire et l’organisation, comme le démontage de l’enveloppe nucléaire, condensation des chromosomes et assemblage du fuseau mitotique. Déréglementation et erreurs dans ces processus causent cancer, malformations congénitales ou mort cellulaire mitotique. Inhibiteurs spécifiques de Cdk1 tels que RO-3306 ont été développés8, qui fournissent des outils puissants pour des études fonctionnelles, et certains de ces inhibiteurs sont actuellement en essais cliniques pour le traitement du cancer (voir9 pour examen).
Nous décrivons ici une analyse de kinase in vitro qui permet l’identification de sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques. Dans ce test, disponible dans le commerce humain Cdk1/cycline B sert de phosphoryler une cible purifiée protéines in vitro. La phosphorylation du substrat augmente sa masse et ajoute deux charges négatives ; par conséquent, phosphorylation réussie est confirmée par un déplacement vers le haut de la bande de protéine gel SDS-page. Sites de phosphorylation de CDK1 spécifiques sont par la suite identifiés par analyse de spectrométrie de masse des protéines in vitro phosphorylée. Pour vous aider avec le plan expérimental, nous passons en revue également d’outils informatiques et de références pour la prédiction des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique de la séquence protéique. En outre, nous décrivons également les protocoles de purification qui donnent des préparations de protéines très pure et homogène pour l’analyse de la kinase. Enfin, les sites de phosphorylation identifiés doivent être vérifiées par des études fonctionnelles et un essai de liaison simple est décrit ici à cet effet. Combiné, c’est une approche très puissante qui donne des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques et permet des études mécanistes dans Comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire7,10,11. Étant donné que cette méthode s’appuie sur les protéines purifiées, il peut être appliqué à n’importe quel modèle organisme et rendements des résultats fiables. Toutefois, la vérification fonctionnelle de la phosphorylation obtenus sites in vitro est conseillée, car les cellules ont des mécanismes réglementaires supplémentaires mis en place, comme des modifications post-traductionnelles, partenaires d’interaction ou localisation cellulaire qui peut rendre les sites de phosphorylation accessibles ou inaccessibles pour la reconnaissance de Cdk1.
CDK1 reconnaît un site de phosphorylation de consensus qui consiste (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), où X est n’importe quel résidu et une sérine ou thréonine est le site de phosphorylation. Particulièrement importante pour la reconnaissance est la présence de la proline en position + 1. En outre, les résidus basiques sont préférés dans les positions + 2 ou + 3, avec la plupart sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique contenant un Lys ou Arg à la + 3 position6,12.
Activation de Cdk1 est étroitement contrôlée et conduit à l’apparition de la mitose1,2,3,4,5. L’activité des kinases cycline-dépendantes dépend en général de leur association avec les cyclines distinctes (cycline A, B, C, D et E chez les humains), qui sont expriment au oscillant niveaux tout au long du cycle cellulaire13. Expression de CDK1 est constante à travers le cycle cellulaire et la régulation de son activité s’appuie sur son association avec les sous-unités régulatrices cycline A et cycline B5,13,14,15, comme ainsi que les modifications post-traductionnelles. Formation du complexe Cdk1/cycline B est nécessaire pour la kinase activation5,14,15,16,17,18. Dans la phase G2, cycline B est traduit dans le cytosol et importée dans le noyau où il se lie à la Cdk15,14,15,16,17,18; Cependant, la Cdk1/cycline B se tient inactivé par phosphorylation aux résidus Thr14 et Tyr15 par les kinases Cdk1-inhibiteur humains Myt1 (kinase cdc2-inhibitrice associées aux membranes tyrosine et thréonine-spécifique) et Wee1, respectivement19, 20,21. Dans la dernière phase G2, déphosphorylation de Thr14 et Tyr15 par la phosphatase de 25 de cycle de division cellulaire (cdc25) permet d’activer l’activité kinasique du complexe Cdk1/cycline B et déclenche l’ouverture de la mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. la phosphorylation de Thr161 est également requise pour l’activation de Cdk1/cycline B et est véhiculé par Cdk7, le Cdk-activating kinase (CAK)18. Dégradation de la cycline B en anaphase inactive Cdk1, permettant la sortie de la mitose24,25. Activation de Cdk1/cycline B est donc un processus complexe. Le protocole présenté ici est exécuté avec commercialement disponible Cdk1/cycline B. Pendant l’expression recombinante de ce complexe dans des cellules d’insectes, il est activé en vivo par des kinases endogènes14,20 et reste actif à l’État purifié. La résultante active, recombinant humain Cdk1/cycline B convient à des essais in vitro kinase.
Nous décrivons ici un protocole pour l’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique dans le centromère humaine protéines F (CENP-F)10. CENP-F est une protéine du kinétochore qui réside dans le noyau pendant la majeure partie de l’interphase (G1 et phase S) et qui est exportée vers le cytosol dans le G2 phase26,27,28 à un Cdk1-dépendante manière10, 11. localisation nucléaire est conférée par une bipartite cNLS26. cNLSs sont reconnus par le facteur de transport nucléaire IMPORTINE α, qui facilite, ainsi que l’IMPORTINE β et RanGDP, l’importation du cNLS-cargo, dans le noyau29. Les exportations nucléaires lors de la phase G2 sont facilitée via une exportation inconnu voie10. Une fois CENP-F se trouve dans le cytosol, il est recruté à l’enveloppe nucléaire et recrute à son tour la protéine motrice complexe dynéine30,31. Cette voie est importante de placer le noyau respectif à centrosome pendant les étapes initiales de l’assemblage du fuseau mitotique de manière dynéine-dépendante, ce qui est importante pour le bon timing d’entrée mitotique et un processus fondamental dans le cerveau développement30,31,32. À partir de la phase G2, CENP-F est aussi rassemblé dans le kinétochore où il a un rôle important pour les fidèles de chromosome ségrégation27,28,33,34,35 . Une étape clé de réglementation de ces voies est l’exportation nucléaire du CENP-F dans la phase G2, qui dépend de la Cdk110,11. Nous décrivons ici un protocole pour l’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique dans le cNLS du CENP-F. Phosphomimetic mutations de ces sites ralentissent import nucléaire du CENP-F, ce qui suggère que la Cdk1/cycline B régule directement localisation cellulaire de CENP-F par la phosphorylation de la cNLS10.
Dans l’ensemble, cette analyse de kinase in vitro permet l’identification des substrats spécifiques pour les protéines cibles de kinase Cdk1. purifiée sont phosphorylées in vitro par Cdk1/cycline B complexe disponible dans le commerce et les sites de phosphorylation sont identifiés par la suite par spectrométrie de masse. L’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifique prend en charge les études mécanistiques qui révèlent comment Cdk1 contrôle du cycle cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre analyse de kinase in vitro est une méthode très puissante pour identifier des cibles moléculaires pour la kinase Cdk1, qui est un contrôleur maître du cycle cellulaire et régule les nombreux processus cellulaires importants. La méthode détermine si une protéine purifiée est un substrat pour la Cdk1 et permet l’identification de sites de phosphorylation spécifiques. Ceci facilite les études mécanistiques pour régulation de processus cellulaires par phosphorylation par l’intermédiaire de C…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr David King, Howard Hughes Medical Institute, Université de Californie à Berkeley pour analyse par spectrométrie de masse et des commentaires utiles. Nous remercions m. Xuelian Zhu, Shanghai, instituts des Sciences biologiques, Académie chinoise des Sciences, Shanghai, en Chine, pour fournir une construction CENP-F pleine longueur. Enfin, nous remercions le Dr Susan Bane, Dr. Brian Callahan et Dr Christof Grewer à l’Université de Binghamton pour l’accès à l’équipement. Cette recherche a été financée par la Fondation de recherche pour la State University of New York et du département de chimie, State University of New York à Binghamton.
Materials
| 2800 ml baffled Fernbach flask | Corning | 44232XL | |
| ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-25 | |
| ATP | Fisher Scientfiic | BP413-25 | |
| benzamidine hydrochloride | Millipore Sigma | B6506-25 | |
| bottletop filter | Corning | 431161 | |
| Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL | New England Biolabs | P6020 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | EMD Millipore | 14-450 | |
| Cdk1/cyclin B (alternate source) | Invitrogen | PV3292 | |
| Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer | New England Biolabs | P6020 | |
| CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid | Available upon request. | ||
| centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor | Thermo Scientific | 10033-778 | |
| centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes | EMD Millipore | UFC900324 | |
| chlorampenicol | Gold Biotechnology | C-105-100 | |
| D/L methionine | Agros Organics / Fisher | 125650010 | |
| desalting pipet tips: Zip tips | Millipore Sigma | ZTC18S008 | |
| disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm | Biorad | 7321010 | |
| dithiothreitol | Gold Biotechnology | DTT50 | |
| E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain | EMD Millipore | 71403 | |
| electrospray ionization Fourier transform ion | Bruker Amazon | Apex III | |
| cyclotron resonance mass spectrometer | |||
| electrospray ionization ion trap mass spectrometer | Bruker Amazon | custom | |
| fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy | Thermo Scientific | 97040-276 | |
| FPLC system: Äkta Pure FPLC | GE Healthcare | 29032697 | |
| Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| glutathione agarose | Pierce | 16101 | |
| glutathione, reduced | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| incubation shaker: multitron shaker | Infors | I10102 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| kanamycin | Gold Biotechnology | K-120-25 | |
| karyopherin α pet-28a pres plasmid | Available upon request. | ||
| Luria Bertani medium | Fisher Scientfiic | BP1426-2 | |
| microcentrifuge 5418R, refrigerated | Eppendorf | 5401000013 | |
| microtubes (0.5 ml) | Eppendorf | 30121023 | |
| microtubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30120086 | |
| Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel | Millipore Sigma | P6611-100ml | |
| pGEX-6P-1 plasmid | Millipore Sigma | GE28-9546-48 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Gold Biotechnology | P470-10 | |
| PS protease: PreScission protease | GE Healthcare | 27084301 | |
| Phos-tag acrylamide | Wako Pure Chem. Ind. | 304-93521 | |
| reduced gluthathione | Millipore Sigma | G4251-50g | |
| roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) | Fisher Scientfiic | 055291D | |
| site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning | Agilent | 210518 | |
| Site-Directed Mutagenesis Kit | |||
| sonifier: Branson S-250D sonifier | Branson | 15 338 125 | |
| Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) | Spectrum Labs | 08 670B | |
| swing out rotor TX-1000 | Thermo Scientific | 10033-778 |
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