核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析
Summary
線虫生殖.の三次元再構成のための自動化手法を提案します。本手法は、数と生殖と生殖細胞蛋白質の分布の解析と細胞骨格構造内にある各核の位置を決定します。
Abstract
線虫(C. elegans) 生殖細胞、幹細胞の開発、アポトーシスと染色体のダイナミクスを含むいくつかの重要な生物学的プロセスの研究に使用されます。生殖細胞はエクセレント モデルが、解析は、しばしば 2 つの時間と労力を三次元解析による寸法です。このような研究の主要な読み出しは、核と生殖細胞内のタンパク質分布の位です。生殖細胞数と生殖細胞の各地域で核の位置を決定する共焦点顕微鏡と計算のアプローチを使用しての自動解析を実行する方法を紹介します。本手法は、また異なる遺伝背景の蛋白質の表現を立体的に調べることができる生殖細胞蛋白質の分布を分析します。さらに、我々 の研究は、特定の空間発達要件に対応することができる生殖の異なる領域で細胞骨格のアーキテクチャでバリエーションを示します。最後に、提案手法は、各生殖の交尾で精子の自動カウントできます。一緒に取られて、私たちのメソッドは、線虫の生殖の迅速かつ再現性のある表現型分析できます。
Introduction
シグナル伝達経路の哺乳類の保全は、複数の生物学的プロセス1,2を研究するエクセレント モデル線虫をなります。私たちの研究室では、線虫の生殖を使用して、遺伝子発現、アポトーシス、幹細胞の開発を研究します。生殖細胞は立体構造が、多くの研究は三次元解析の時間のかかり、労働集約的な性質のため二次元です。二次元解析が生殖細胞の生体内でイベントを偽ることがあります可能性が高いです。線虫 c. エレガンス大人の両性具有者がそれぞれの家は遠位生殖細胞未分化状態3,4を維持体の遠位先端細胞 (DTC)、2 つの生殖腕。これらの生殖細胞はその影響をエスケープ、DTC から離れるにつれて分化を開始して生殖細胞の近位端に達する彼らと卵子と精子になります。このプロセス中に胚細胞核は減数分裂5,6に移行する前に有糸分裂を経る。精子の生産はその後卵母細胞は成人で作成される開発の幼虫 4 (L4) によって完了です。精子は、卵子の胚を生成する肥やす交尾に格納されます。
線虫核の数, アポトーシス イベント、染色体ダイナミクスとタンパク質の発現や局在7 の番号変更を伴う生殖細胞の発生に影響を与えることができる複数の遺伝子と環境要因があります。 ,8,9,10,11。これらのイベントの分析には、核の形態と分布に基づく分化の各段階の身分証明書が必要です。大規模なサンプル サイズを手動でこれらのパラメーターを正確に分析するには、手間と時間がかかるです。カウント核、核の分布、蛋白質の表現、線虫の生殖の三次元検査のための自動方法を開発したこれらの欠点を回避するために、解析の整合性を有効にするには、細胞骨格と構造体です。三次元レンダリングと共焦点顕微鏡を用いて生殖細胞分化の各段階の身分証明書のサイズと形状パラメーターを生成されます。さらに、このメソッドは、生殖細胞の核と精子のカウントに加えて各卵母細胞における染色体数の得点できます。
生殖細胞の 1 つ重要な構造が細胞骨格、生殖細胞コンパートメント、エイズ細胞質ストリーミングと生殖核12保護に安定性を提供します。計算のレンダリングを使用すると、生殖細胞骨格の 3次元再構築を実施し、生殖細胞内の異なる細胞骨格機能を識別.ここでは、線虫の生殖の共焦点イメージングにより包括的な分析と組み合わせる方法計算の分析を説明するためにステップバイ ステップのプロトコルについて述べる。
急速な線虫の生殖 (図 1) の三次元解析法を提案します。三次元解析を使用して、セル (図 2) 生殖細胞系列の細胞骨格 (の再構築の自動化 (図 2および図 3) 生殖核の三次元分布カウントを研究することが可能です。図 3)、タンパク質 (図 4) や、交尾で精子と卵母細胞 (図 5) の染色体数を得点の分布。メソッドは、生殖細胞を簡単かつ正確な数量化できるだけでなく、生理学的に関連する表現型を識別します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの目標は、精度を向上させる・生殖細胞の解析に必要な時間を短縮することです。切り裂かれた germlines の標準的な準備の後、生殖核の三次元モデルは計算のレンダリングによって準備されます。空間における生殖核分布の観測を可能にしながら、三次元レンダリングは生殖細胞の特定の領域での核の数を計算します。本手法の重要な側面は、原子核のサイズと形状パラメー?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼らのテクニカル サポートありがとうモナッシュ マイクロ イメージング。いくつかの系統は、線虫の遺伝学センター研究インフラストラクチャ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。この作品は、モナッシュ大学生物医学発見交わり、NHMRC プロジェクト助成金 (GNT1105374)、NHMRC 上級研究員 (GNT1137645) と veski 社革新交わりによって支えられた: ロジャー ・ ポコックに VIF 23。
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
Referenzen
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