Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.
Bakteri, çeşitli bitki hastalıklarının en önemli etken ajanlarından biri efektör proteinler birtakım bitki bağışıklık sistemi yıkmak için ana bitki hücre salgılar. Enfeksiyon sırasında sitoplazmik effectors ana bilgisayar sitozol bir tip III salgı sistemi (T3SS) ile teslim edilir. Bitki hücre içine doğumdan sonra effector(s) ana hücre işlemleri için hayatta kalma ve çoğaltma patojenin modüle için belirli compartment(s) hedefler. Ortada olmasına rağmen biraz araştırma hücre altı yerelleştirme doğrudan enjekte bakterilerden effectors dinamikleri incelenmesi floresan proteinler, kullanarak patojenitesi içinde onların işlevini anlamak için ana bilgisayar hücrelerdeki efektör proteinlerin üzerinde T3SS ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk nedeniyle zor oldu.
Burada, konak hücre içinde bakteriyel T3SS üzerinden teslim effectors lokalizasyonu görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bölünmüş superfolder yeşil flüoresan protein sistemin (sfGFPOPT) bizim son yöntem açıklanmaktadır. SfGFP11 (11inci β-strand sfGFP)-tagged efektör T3SS salgılanan monte belirli organel hedef sfGFP1-10OPT (1-10th β-strand sfGFP) lideri ile floresan emisyon sitesinde için. Bu iletişim kuralı Sulandırılan sfGFP floresan sinyal Pseudomonas syringae Arabidopsis ve Nicotiana benthamiana tesislerinde belirli bir organel içinde bir efektör protein ile görselleştirmek için bir yordam sağlar.
Bitkilerin bakteri, mantar, virüs, böcekler ve onların yaşam döngüsü boyunca nematodlar dahil olmak üzere çok sayıda işgal patojenler karşılaşma sesil organizmalardır. Phytopathogens arasında Pseudomonas spp. ve Ralstonia spp., gibi gram-negatif bakteriyel patojenlere bulaştırmak onların ana bitkiler yaralar veya stoma bantlı ve hydathode gibi doğal açıklıklar üzerinden girerek1. Başarılı bir şekilde ev sahibi bitkiler kolonize etmek bakteriyel patojenler virülans faktörleri2çeşitli geliştirmek için evrim geçirmiş. Ana bitki bakteri istila zaman onlar bir dizi virülans protein enjekte — effectors bilinen — onların patojenitesi tanıtmak için doğrudan bitki hücreleri içine. Bu effectors bastırmak veya bitki doğuştan gelen bağışıklık modüle ve bakteriyel hayatta kalma3‘ neden için ana hücresel işlemleri işlemek.
Patojen bakteriler bir T3SS efektör proteinler doğrudan ana hücreleri4sunmak için esas olarak kullanın. T3SS moleküler bir şırınga bir iskele protein yapısından iç ve dış bakteriyel membranlar arasında konak hücre5enjeksiyon sitesine bağlanma bir iğne gibi kanal ile benzer. Bu T3SS-aracılı efektör (T3E) salgılanması çeşitli Ayagin Gram-negatif bakteri patojenlerin bitki iyi korunmuş gibi insan mekanizmasıdır. Bir temsilci bitki patojenleri, P. syringae pv. Domates Genellikle hatalı bir T3SS vardır DC3000 hrcC mutant tamamen bitki bağışıklık (tarafından efektör protein enjekte)6bastırmak için bu mutant yetersizlik nedeniyle büyük olasılıkla bitkilerde büyüme sınırlı. Konak hücre içine translocation effectors bitki savunma yanıt, Gen transkripsiyonu, hücre ölümü, proteasome, vezikül kaçakçılığı ve hormon yolları7 de dahil olmak üzere ana hücre sistemi için önemlidir çeşitli ana bilgisayar proteinlerin hedef. , 8 , 9 , 10. bu nedenle, ana bilgisayar hücrelerdeki efektör proteinlerin hücresel yerelleştirme izleme işlevlerini bitki bağışıklık modülasyonu ile ilgili anlamak için çekici bir hedeftir.
T3Es yerelleştirme çalışmaların en aracılı Agrobacterium –overexpression ana bitki9büyük floresans protein ile istihdam. Ancak, diğer türler tanıttı genler için kapaklı ifade yöntemi yanlış lokalize ya da zaman zaman işlevsel11,12,13olmak gösterilmiştir. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda bakteriyel effectors uygun ana hücreleri14‘ te,15,16,17hedefleme için değişiklik tabi ortaya koydu. Bu nedenle, geçici effectors hücreleri üzerine patojen bulaşma18T3SS tarafından teslim effectors için işlevsel olarak veya kantitatif aynı olmayabilir bitki sitozol içinde dile getirdi. Ayrıca, efektör proteinler için büyük floresan Etiketler füzyon uygun efektör teslim ve görselleştirme18,19bozabilir. Bu nedenle, bu yaklaşımlardan T3E işlevi tahlil T3SS salgılanan effectors yerli lokalizasyonu tam olarak yansıtmıyor olabilir.
Yeşil flüoresan protein (GFP) bir 11 iplikli β-chromophore20içerir bir merkez strand kapsayan varil oluşur. Waldo vd. küçük bir parçası oluşan bir roman split-GFP sistem bildirdi (GFP β strand 11; GFP11) ve büyük bir tamamlayıcı parçası (GFP β strand 1-10; GFP1-10)21. Parçaları kendileri tarafından belli değil ama her iki parçaları birbirleri ile yakın olduğunda kendini onların dernek bulabilsem. Protein katlama verimliliği optimizasyonu için sağlam katlama türevleri GFP, yani, sfGFP ve sfGFPOPT, daha sonra için split GFP sistem20,21,22geliştirilmiştir. Son zamanlarda, değişik-bir sfGFP11 parçası ve gösteri sarı ve mavi floresan ile sırasıyla yeniden oluşturmak, oluşturulan23 olduğunu sfGFP1-10OPT– sfYFP1-10OPT ve sfCFP1-10OPT– in tek amino asit mutasyona uğramış . Ayrıca, sfCherry, mCherry, bir türevi bölebilirsiniz aynı şekilde sfGFP23olarak sfCherry1-10 ve sfCherry11 parçalara.
Bu sistem etiket ve Salmonella24. effectors kullanarak enfeksiyon sırasında T3SS effectors HeLa hücreleri içinde izlemek için adapte edilmiş Ancak, bu daha önce ana bitki-bakteriyel pathogen sistemi için optimize edildi değil. Son zamanlarda, bitki hücreleri25 P. syringae teslim T3Es hücre altı lokalizasyonu izlemek için geliştirilmiş sfGFP1-10OPT dayalı split GFP sistemi optimize. T3Es bitki hücrelerinde, transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi farklı hücre altı bölmeleri için yerelleştirme çalışmaları kolaylaştırmak için bitkiler sfGFP1-10OPT çeşitli hücre altı bölmeleri ifade etmek için oluşturulan 25. Ayrıca, çeşitli taşıyan plazmidlerin organel sfGFP1-10OPT için Agrobacteriumhedefli-aracılı geçici overexpression ve T3SS tabanlı efektör teslimat için sfGFP11 öğesini vektörler da oluşturmak. Çeşitli transgenik Arabidopsis satırları ve T3Es ilgi ifade etmek için plazmid tohumları Malzemeler tablo26,27‘ belirtilen kaynaklardan elde edilebilir.
Aşağıdaki iletişim kuralında, split sfGFP sistemi kullanarak konak hücreleri bakteri tarafından teslim effectors dinamikleri izlemek için en iyi duruma getirilmiş bir sistemi açıklanmaktadır. Enfeksiyon sfGFP1-10OPT transgenik Pseudomonas rekombinant sfGFP11 plazmid taşıyan ile ifade bitkilerin sfGFP11 öğesini efektör teslimini Pseudomonas üzerinden ana hücre içine sonuçlanır. Sonuç olarak, bu proteinler yeniden ve belirli efektör hedef compartment(s) için translocate. Pseudomonas syringae pv. domates CUCPB5500 gerilim içinde 18 effectors silinir, bu zorlanma A. thaliana ve i. benthamianas28yılında düşük veya hiç hücre ölümü öğrettin kullanıldı. Ancak, tüm malzemeler ve burada açıklanan adımları değiştirilmesi veya diğer biyolojik sorular veya optimizasyonu belirli laboratuvar koşullarında soruşturma için split sfGFP sistemi adapte değiştirilmiş.
Burada açıklanan protokol ana bilgisayar bitki hücre üzerine enfeksiyon Bakteriyel T3SS tarafından enjekte efektör proteinlerin doğru yerelleştirme izlenmesi için kullanılır. Daha önce split GFP sistemi bir araç olarak hücre altı yerelleştirme memeli proteinler23,36, Salmonella T3E yerelleştirme ve Agrobacterium VirE2 teslim T4SS ile çalışmak için kullanılan bitki hücreleri37. Bitki hücreleri bu si…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı, ICT ve etki alanı denetleyicisinin gelecekteki planlama (NMK-2018R1A2A1A05019892) ve () bitki moleküler ıslah merkezi bir hibe tarafından desteklenen NMK) tarafından desteklenmiştir PMBC) EP için Kırsal Kalkınma İdaresi (PJ013201) sonraki nesil Biogreen 21 programı Görüntüleme Merkezi Ulusal araçları merkezi filme confocal mikroskop sağlamak çevre yönetim için teşekkür ediyoruz.
Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
Bacterial strains | |||
Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
Media components | |||
Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
Confocal microscope equipments/materials | |||
710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |