Summary
Este protocolo descreve calorespirometry, a medição direta e simultânea de dissipação de calor e de respiração, que fornece uma abordagem não-invasiva para avaliar o metabolismo energético. Esta técnica é usada para avaliar a contribuição das vias aeróbias e anaeróbias para utilização de energia, monitorando o fluxo de energia celular total.
Abstract
Muitas linhas de celulares usadas em pesquisa biológica e biomédica básica mantenham a homeostase de energia através de uma combinação da respiração aeróbia e anaeróbia. No entanto, na medida em que ambos os caminhos contribuem para a paisagem da produção de energia celular é consistentemente ignorada. Células transformadas cultivadas em saturando os níveis de glicose frequentemente mostram uma diminuição da dependência na fosforilação oxidativa para a produção de ATP, que é compensada por um aumento no nível de substrato fosforilação. Essa mudança no equilíbrio metabólico permite que as células a proliferar apesar da presença de toxinas mitocondriais. Em negligenciar a poise metabólica alterada de células transformadas, resultados de um rastreio farmacêutico podem ser mal interpretados desde o potencialmente mitotoxic efeitos podem não ser detectados usando linhas de célula modelo cultivadas na presença de glicose alta concentrações. Este protocolo descreve o emparelhamento de duas técnicas poderosas, respirometria e calorimetria, que permite a avaliação quantitativa e não-invasiva de contribuições aeróbias e anaeróbias para produção de ATP celular. Respiração aeróbia e anaeróbia gera calor, que pode ser monitorado através de calorimetria. Enquanto isso, a medição da taxa de consumo de oxigênio pode avaliar o grau de respiração aeróbia. Quando tanto a dissipação de calor e consumo de oxigênio são medidos simultaneamente, a relação de calorespirometric pode ser determinada. O valor obtido experimentalmente em seguida pode ser comparado com a oxycaloric teórico equivalente e a extensão da respiração anaeróbica pode ser julgada. Assim, o calorespirometry fornece um método exclusivo para analisar uma ampla gama de questões biológicas, incluindo o desenvolvimento de drogas, crescimento microbiano e bioenergética fundamental sob condições de hipóxicos e normoxic.
Introduction
Em sistemas biológicos, a libertação de calor ou entalpia de mudança durante o metabolismo normalmente é monitorado ou diretamente (via directa calorimetria) ou indiretamente através do consumo de O2 e/ou produção de CO2 (através de respirometria). Infelizmente, quando estas técnicas são utilizadas em isolamento, informação crítica é perdida, tais como a contribuição das vias anaeróbias para o metabolismo celular. Calorespirometry é uma técnica poderosa que se baseia na medição simultânea de dissipação de calor e a respiração. Calorespirometric trabalho pioneiro investigou o metabolismo anaeróbico em células de mamíferos totalmente oxigenados e demonstrado contribuições simultâneas das vias aeróbias e anaeróbias, a homeostase de energia, apesar das células transformadas em uma ambiente totalmente oxigenado1. Calorespirometry desde que foi aplicado a uma grande variedade de questões biológicas. Alguns exemplos incluem o estudo da energética animal em baixos níveis de oxigênio, os efeitos do herbicida e do estrogênio sobre as brânquias de moluscos bivalves, o metabolismo de organismos terrestres e a decomposição microbiana do solo orgânico matéria2, 3 , 4 , 5 , 6. Além disso, calorespirometry tem revelado como metabólica pré-condicionamento antes da congelação melhora a criopreservação de mamíferos células7. Cada abordagem, tanto calorimetria e respirometria, independente aumentou nosso conhecimento do celular e a Bioenergética. No entanto, questões biológicas fundamentais que podem ser respondidas através da utilização de calorespirometry permanecem relativamente inexploradas.
Lei de Hess afirma que a mudança de entalpia total de uma reação é independente do percurso entre os Estados iniciais e finais. Por exemplo, a mudança de entalpia total para uma via metabólica é o somatório da variação enthalpies de todas as reações dentro da via. Calorimetria oferece uma abordagem em tempo real para medir a produção de calor celular, que detecta indiscriminadamente vias aeróbias e anaeróbias. Isto é baseado na Fundação que nenhuma energia é trocada no sistema exceto pelas paredes da ampola experimental8. Uma mudança na dissipação de calor é igual à mudança na entalpia liberada de todas as reações metabólicas em ampola. Assim, uma entalpia negativa se correlaciona com a perda de calor do sistema. Exaustiva pesquisa nas últimas quatro décadas tem caracterizado a paisagem termodinâmica de catabolismo e o anabolismo. Isso é representado por um aumento constante nos artigos de pesquisa encontrado sob os termos de busca "biológicos" e "calorimetria" como indexados pelos Estados Unidos nacional biblioteca da medicina (NLM) no National Institutes of Health (PubMed). A pesquisa revela que antes de 1970, um total de 27 publicações calorimetria biológicos de referência; Enquanto isso, no ano de 2016, 546 publicações utilizaram a técnica.
Os métodos calorimétricos são bem estabelecidos para determinar a produção de calor. No entanto, mais flexibilidade é concedida para resolver o valor respirometric. A medição de respirometric pode consistir de O2, CO2, ou tanto O2 e CO2. Além disso, a medição de O2 e CO2 pode ser realizada por várias técnicas, incluindo optrodes, eletrodos tipo Clark e diodo ajustável do laser absorção espectroscopia7,9,10 ,11. Enquanto a produção de CO2 é uma métrica valiosa em muitos estudos respirometric, o meio para pilhas cultivadas frequentemente utiliza um sistema de reserva de bicarbonic para controle de pH12,13. Para evitar complicações da medição de CO2 no sistema de bicarbonato, o seguinte protocolo para o calorespirometry das células em cultura utiliza O2 como o único parâmetro de respirometric.
Simultâneas com medição de fluxo de oxigênio, certas respirometers (ver Tabela de materiais) são projetados para avaliações detalhadas da função mitocondrial. Substrato-desacoplador-inibidor-titulações (SUIT) protocolos são bem estabelecidos e são compatíveis com os experimentos para medir a membrana potencial ou reativas de oxigênio (ROS) de espécies formação14. O protocolo apresentado por calorespirometry de células intactas é compatível com a introdução de produtos químicos uncouplers como carbonila cianeto-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) e a F0F1-ATP sintase inibidor oligomicina. Através da adição de FCCP, consumo de oxigênio pode ser desacoplado da produção de ATP, que é útil para avaliar o impacto da terapêutica potencial mitocondrial peformance15. Além disso, a adição de oligomicina acende-se a extensão da respiração de vazamento. Assim, as respirometric medições realizadas calorespirometry são compatíveis com protocolos extensivos projetados para elucidar ainda mais a fisiologia mitocondrial.
A medição simultânea de dissipação de calor e de fluxo de oxigênio permite o cálculo da relação de calorespirometric (CR). Esta relação é então comparada com a constante do Thornton ou a oxycaloric teórico equivalente, que varia entre-430 ao-480 kJ mol-1 , dependendo da linhagem de células ou tecidos de interesse e o de substratos de carbono completados1, 16. assim, uma relação de CR mais negativa revela aumentada contribuições de vias anaeróbias a atividade metabólica geral. Por exemplo, a proporção de CR para a respiração do tecido muscular rotina sem o desempenho ativo de trabalho varia de-448 a-468 kJ mol-1, que está dentro do intervalo dos teóricos oxycaloric equivalente17,18. Enquanto isso, células de câncer mamíferos cultivadas em meio que é rico em glicose exibir reforçada ácido lático fermentação glicólise a seguir e relativamente baixo envolvimento mitocondrial19. Este resultados de fenótipo em rácios de CR no intervalo de-490 a-800 kJ mol-1, demonstrando um maior envolvimento das vias anaeróbias no metabolismo celular como indicado pelo negativo mais CR rácios1,7, 16,20.
Distribuidores comerciais e sem fins lucrativos de célula e tecido atualmente oferta de linhas de celulares de mais de 150 espécies, com quase 4.000 linhas de células derivadas de seres humanos. Linha celular imortalizado é ferramentas convenientes para avaliar rapidamente a toxicidade da terapêutica potencial, muitos dos quais direta ou indiretamente interferem com funções mitocondriais. Usar células transformadas durante o rastreio de drogas pode ser de valor preditivo limitado em parte por causa do efeito Warburg, uma marca registrada de muitos cancros. Muitas vezes, cancros geram ATP de fosforilação do substrato-nível e mantêm equilíbrio redox através da produção de lactato sem engajar-se totalmente a mitocôndria sob condições aeróbias19. Desenvolvimento farmacêutico é notoriamente caro e ineficiente, com aproximadamente 8 em 9 compostos testados em ensaios clínicos humanos não atingirem o mercado aprovação21. Enquanto terapêutica potencial pode passar triagem inicial devido à baixa citotoxicidade em linhas celulares, é possível que alguns destes compostos são mitotoxic. Sem um método adequado para detectar como estas toxinas podem prejudicar o equilíbrio de energia em células primárias que não exibem o efeito Warburg, informação crítica é muitas vezes excessivamente olhou, descongestionamento desenvolvimento terapêutico em estágios iniciais.
Calorespirometry é uma abordagem prática e não-invasiva para analisar a atividade metabólica em uma variedade de amostras biológicas, incluindo células e tecidos. O núcleo do protocolo apresentado é compatível com uma variedade de aplicações. Uma complicação, no entanto, foi identificada. Células imortalizadas geralmente são cultivadas em um meio isento de glicose suplementado com galactose para aumentar a contribuição da fosforilação oxidativa (OXPHOS) para a produção de energia, a fim de sensibilizar as células com potencial mitotoxins22, 23. Esta reprogramação metabólica parece obscurecer a análise quando amostras são colocadas nas ampolas de aço inoxidável usadas pelo calorímetro15. As células cultivadas em meio de glicose continuam a se envolver em alta atividade metabólica durante várias horas. Enquanto isso, células cultivadas em meio de galactose diminuem a produção de calor dentro de 30 min de sua colocação em ampola, fazer medições restritas aos pontos de início tempo experimental. Este comportamento, infelizmente, dificulta a oportunidade de avaliar sua proliferação celular. Apesar desta limitação específica, a maioria dos aplicativos são compatíveis com análise de calorespirometric e metabólicas obter informações detalhadas podem ser obtidas através desta abordagem.
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Protocol
1. cultura de pilha
- Manter as células de carcinoma (HepG2) hepatocelular humano médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e substratos adicionais (10 mM glicose, glutamina 2 mM e piruvato de 1 mM) a 37 ° C numa incubadora de cultura celular (5% CO2 , ar de 95%, 100% de umidade).
Nota: Use a formulação DMEM acima quando DMEM é referenciado em etapas posteriores para respirometria e calorimetria. - Placa as células em 1 x 106 células por placa de cultura de 100mm e subcultura-las cada 7 dias ou antes de chegar a 90% de confluência e renovar o médio a cada 3-4 dias.
- Realize os experimentos que, quando as células são de 60-80% de Confluencia.
2. preparação de Respirometer e calorímetro
- Pipetar 2,2 mL de DMEM na câmara respirometer, tapar totalmente e ajustá-lo com a ferramenta de espaçador de rolha para permitir a difusão do ideal de oxigênio do ar para médio.
- Mexa continuamente a 37 ° C até que a concentração de oxigênio (traço azul) e o fluxo de oxigênio (traço vermelho) são estáveis. Certifique-se de que software a respirometer é programado para dar conta da solubilidade de oxigênio do meio utilizado no experimento.
Nota: Diferentes meios de comunicação têm coeficientes de solubilidade de oxigênio diferentes (por exemplo, DMEM = 0,92). - Após a estabilização da concentração de oxigênio em DMEM com a câmara aberta, selecione uma parte estável do rastreamento de concentração de oxigênio e calibrá-lo para a saturação do ar de 100%.
- Calibre para oxigênio de 0%, selecionando uma parte estável do rastreamento de concentração de oxigênio quando o oxigênio não está presente na câmara. Execute esta etapa após 20 titulação µ l de 230 mM ditionito de sódio ou após todo o oxigênio é consumido pela amostra biológica no final do experimento.
- Após a calibração de ar de 100% do respirometer, feche o bujão e certifique-se de que não há bolhas estão presentes na câmara.
Nota: um ligeiro aumento no fluxo de oxigênio será detectado na câmara fechada como o sensor de oxigênio polarographic (POS) consome oxigênio para medir a pressão parcial de oxigênio. - Depois de ~ 10 min da rolha sendo fechada, confirme que o respirometer está pronto para células HepG2, observando um fluxo estável de oxigênio.
Nota: O calorímetro usado aqui utiliza ampola de aço inoxidável e requer uma ampola para ser usado como uma referência. - Adicionar 2,5 mL de H2O (dH2O) [volume igual como as amostras (etapa 4)] para a ampola de referência do calorímetro e aperte a tampa, usando um alicate, se necessário. Limpe a ampola selada com fluxo de ar e abaixe lentamente a ampola na posição 1 no canal de referência do calorímetro. Permanecem na posição 1 até amostra biológica é preparada.
3. preparação de células HepG2 para respirometria e calorimetria
- Confirme que o respirometer e o calorímetro são preparados e calibrados. Quente DMEM e tripsina a 37 ° C em banho-maria.
- Adicione DMEM para uma placa de 100mm fresca e lugar na incubadora para permitir o equilíbrio do meio para CO2 e temperatura.
Nota: Este meio será usado para o experimento de calorimetria, então o volume apropriado depende do número de ampolas que será usado. - Confirme com um microscópio invertido que as células estão em 60-80% de confluencia, depois lave a 100mm-placa 2 x com 10 mL de temperatura fosfato salino (PBS).
- Adicionar 3 mL de tripsina de C a 37 ° a 100mm placa de células e incube-os por 7-10 min a 37 ° C, a incubadora de cultura de células. Neutralizar a tripsina com 3 mL de 37 ° C DMEM e suspender pipetando suavemente-~ 20 vezes com uma pipeta de 5 mL.
- Transferir a 6 mL de células ressuspensa em DMEM e tripsina em um tubo cônico de 15 mL estéril e centrifugue por 5 min à 175 g. x remover o líquido sem perturbar o centrifugado.
- Resuspenda o pellet de células em ~ 5 mL de DMEM e pipetar cuidadosamente para garantir que as células são suficientemente dissociado um do outro.
- Remova ~ 100 µ l da amostra bem misturada e realizar uma contagem completa de células utilizando todos os 8 campos em um hemocytometer para determinar o número total de células. Em seguida, calcule o volume para ressuspensão das células para gerar ~ 2 x 106 células por 50 µ l.
Nota: Isto irá garantir que a 2 x 106 células são adicionadas a cada câmara do respirometer com deslocamento médio mínimo. - Centrifugar as células durante 5 min à 175 x g. Ressuspender o sedimento do volume calculado de DMEM da etapa 3.7.
- Realize uma contagem de células, para determinar o volume necessário para injetar 2 x 106 células por câmara no respirometer (isto deve ser ~ 50 µ l). Armazene as células para a medição de respirometric no gelo até que esteja pronto.
- Enquanto a amostra concentrada de células está no gelo, determine a diluição necessária para produzir uma concentração de 1 x 105 células/mL para a calorimetria.
- Misturar a amostra bem e prepare-se para cada ampola ~ 3 mL de células a 1 x 105 células/mL em DMEM.
Nota: O DMEM usado para a diluição da amostra deve ser o meio equilibrado, preparado na etapa 3.3.
4. calorimetria
- Garantir que o calorímetro é conectado ao computador e o sinal calorimétricos em µW é observável e estável.
- Adicionar 2,5 mL de células a 1 x 105 células/mL (5 células de ~2.5 x 10) para cada ampola, garantir o suficiente de ar entre a tampa da ampola e o meio para permitir a difusão do gás.
- Imediatamente aperte a tampa, usando um alicate, se necessário. Limpe a ampola selada, usando o fluxo de ar para remover quaisquer resíduos externos e abaixe lentamente a ampola na posição 1 do calorímetro. Registre o tempo que a ampola é abaixada na posição 1.
- Permitir que a ampola sentar-se na posição 1 por 15 min.
Nota: Durante este período de 15 min, as células são para ser injetado o respirometer (passo 5). Isso garante que o mesmo intervalo de tempo é usado para produção de calor e consumo de oxigênio, quando a relação de CR é determinada. - Após 15 minutos na posição 1, abaixe lentamente a referência e a amostra ampolas para a posição 2. Registra o tempo que as ampolas estavam abaixadas e medida pelo menos 30 min.
5. respirometria
- Durante o intervalo de 15 min em que a ampola está na posição 1 no calorímetro, começa os estudos respirometric.
- Misture bem a amostra de células pipetando para garantir uma solução homogénea e injetar < 50 µ l da amostra em cada câmara do respirometer para uma concentração final de ~ 2 x 106 células/câmara celular. Registre o tempo em que as células são injetadas no respirometer.
- Após a injeção, as células HepG2 são continuamente agitou a 37 ° C. Espere pelo menos 20-30 min para ambos uma estabilização do fluxo de oxigênio e uma diminuição constante da concentração de oxigênio.
- Selecione a guia de fluxo de2 O por V à direita da tela e realçar uma porção estável do fluxo de oxigênio. Selecione marcas, então as estatísticas e dados do registro para o fluxo de O2 por V. Esta gravação será usada no cálculo do rácio da CR.
Nota: As etapas 5.5 e 5.6 são opcionais. Vazamento de respiração e respiração desacoplada máxima serão revelados por titulações de oligomicina e Compararia. - Injetar 1 µ l de oligomicina 4mg/mL em cada câmara e permitir ~ 10 min para a estabilização do fluxo de oxigênio. Taxa de respiração vazamento estável registro seguindo as etapas executadas em 5.4 destacando uma parte estável do rastreamento de fluxo de oxigênio após adição de oligomicina.
- Titula-se injeções de 2 µ l de 0,2 mM Compararia em cada câmara, permitindo a estabilização de fluxo de oxigênio após cada injeção. Continue as titulações até o fluxo máximo é atingido, como indicado por um ligeiro decréscimo na titulação Compararia subsequente. A taxa de respiração estável durante o fluxo máximo de registro.
6. cálculo do rácio de Calorespirometric
- Realizar uma contagem de célula final das amostras preparadas em ~ 1 x 105 células/mL, utilizando todos os 8 campos de um hemocytometer para determinar o número total de células adicionado à ampola (2,5 mL).
- Determine um tempo para gravar medições do calorímetro e respirometer no qual estáveis sinais estão presentes em momentos idênticos. Referência que o tempo registrado quando a ampola foi reduzida para a posição 2 e o tempo de injeção de células para o respirometer.
- Grave a produção de calor, colocando o cursor sobre o rastreamento exibir a saída de calor para a ampola respeitada no momento determinado na etapa e expressa como µW/milhões de células. Coletar dados de consumo de oxigênio e certifique-se de que ele é expresso como pmol O2 x s-1 x milhões de células.
- Para calcular a taxa de CR, primeiro converta µW em kJ/s e depois dividir kJ/s por mol de O2/s para obter a relação de CR, expressada em kJ/mol O2. Nota: A relação do CR é apresentada em kJ/mol O2.
(ver arquivo complementar 1)
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Representative Results
A reprodutibilidade das medições calorespirometric depende de uma preparação de amostra adequada e consistente. Amostras preparadas a partir de cultura de células não devem ser usadas se as placas são abandonadas, como contagem de células pode se tornar imprecisa devido à aglutinação. Além disso, os fluxos de calor reduzida devido à difusão do substrato limitada nas células agrupadas podem ocorrer. Portanto, quando usando células aderentes, é crítico para selecionar uma placa com a confluência entre 60-80% e para mudar o meio 24 h antes do experimento.
Manutenção e calibração instrumental adequada também são críticos para medições de calorespirometric informativo e reprodutíveis. Seguindo as indicações do fabricante estabeleceram protocolo de limpeza para o respirometer, extensas lavagens com etanol são implementadas para assegurar que inibidores e uncouplers hidrofóbicos residuais são removidos e não comprometer as medições por parcialmente inibição ou desacopladas mitocôndrias. Quando a câmara respirometer está funcionando antes da medição da amostra, tanto a concentração de oxigênio e os vestígios de fluxo de oxigênio devem ser estáveis, conforme mostrado na Figura 1. Se o POS precisa de serviço de sensor, o fluxo de oxigênio não vai estabilizar, como visto na Figura 2. Medições não devem ser realizadas quando o POS não é atendida adequadamente. Além disso, ampola utilizadas no calorímetro devem ser limpos, esterilizadas e secos antes da utilização, como a contaminação biológica pode interferir com a produção de calor da amostra.
Amostras de células são preparadas após a calibração adequada e a preparação de ambos o respirometer e o calorímetro. Primeiro, a rolha no respirometer está fechada e a câmara é inspecionada para garantir que não há bolhas de ar estão presentes. Em seguida, células HepG2 são concentradas para ~ 2 x 10 µ l de650 para respirometria e imediatamente colocadas no gelo. Para a calorimetria, células HepG2 da amostra concentrada são diluídas em DMEM equilibrado em ~ 1 x 105 células/mL. Depois que as células estão bem misturadas por pipetagem, 2,5 mL da suspensão é adicionado para uma ampola estéril. A ampola está hermeticamente fechada, e quaisquer detritos externo é removido por ampola com um fluxo de ar de uma bomba de ar de sopro. A ampola é então lentamente abaixada na posição 1, onde permanece por 15 min. Depois de 15 min passou, a referência e a amostra de ampolas são, em seguida, lentamente baixou a posição 2 e medições podem começar a ser gravado, uma vez que o calor da saída é estável (Figura 3).
Uma contagem final é realizada após as células são adicionadas para o calorímetro e o respirometer para determinar o número exacto de células introduzido o calorímetro. Então, a produção de calor é expressa por milhões de células. Se as células HepG2 são cultivadas na ausência de glicose e galactose é completada para aumentar o envolvimento mitocondrial, as células não se proliferam dentro do calorímetro, mas em vez disso, diminuem sua atividade metabólica após cerca de 30 min na ampola de. Isso restringe o cálculo do CR para o primeiro ponto de tempo no qual foi medida a dissipação de calor (Figura 4).
É fundamental para registrar o tempo em que as células são adicionadas para a ampola para que as medições de consumo de calor produção e oxigênio são coletadas em pontos de tempo idêntico. Se esta precaução não forem tomada, importantes erros experimentais podem ser introduzidos na determinação da relação de CR. Durante o período de 15 min, enquanto a ampola está na posição 1 no calorímetro, as células são suficientemente misturadas pipetando-los, e 2 x 106 células são injetadas respirometer através de uma seringa de Hamilton. Fluxo de oxigênio estabiliza após aproximadamente 15 min e oxigênio concentração declina firmemente (Figura 5). Novamente, é fundamental que o tempo de injeção da amostra é registrado para análise de dados. O fluxo de oxigênio estabilizado das células serve como o substituto para o consumo de oxigênio quando o cálculo do rácio de CR. Titulações adicionais são realizadas para avaliar a respiração de vazamento (1 µ l oligomicina) indicada por uma gota de um baixo fluxo de oxigênio e a respiração desacoplada máxima (3-5 titulações de 2 µ l FCCP) indicada pela incapacidade de aumentar a respiração após sucessivas Titulações de FCCP. Um desacoplamento incompleta ou uma inibição da respiração não pode ser observado se o estoque Compararia expirou (Figura 6).
Calibração de ar Figura 1:100 % de respirometer e status do sensor de oxigênio polarographic (POS). Os sinais para a concentração de oxigênio (linha azul) e o fluxo de oxigênio (linha vermelha), que ambos estabilizar antes a calibração de ar de 100%. As linhas estáveis indicam que o respirometer está pronto para a calibração. A calibração deve ser realizada em DMEM e não em H2O. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: POS na necessidade de serviço. Após a estabilização da concentração de oxigênio (traço azul), o fluxo de oxigênio (traço vermelho) não consegue estabilizar. O POS não deve ser usado para a experimentação e serviço deve ser aplicado conforme descrito pelo fabricante. Uma maior instabilidade do fluxo de oxigênio se correlaciona com um aumento da demanda por serviço de POS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aproximadamente 2,5 x 105 HepG2 células cultivadas em meio de glicose mostram sinais de proliferação no calorímetro. ~2.5 x 105 HepG2 células cultivadas na presença de glicose por ampola de carga gera uma produção de calor constante de -20 a-28 µW usando a configuração de 30-µW no instrumento e uma produção de calor aumentada ao longo do tempo se correlaciona com a proliferação celular dentro da ampola. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Aproximadamente 2,5 x 105 HepG2 células cultivadas em meio de galactose não proliferam e calor diminui a produção ao longo do tempo. Carregando ~2.5 x 105 HepG2 células cultivadas em galactose por resultados de ampola em uma produção de calor imediata do ~ µW-20. No entanto, a produção de calor diminui com o tempo e restringe as medições CR-relação de pontos de tempo de início do experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: rotina, desacoplada e vazar a respiração das células HepG2. Uma vez que as células foram injetadas a respirometer, concentração de oxigênio diminuído constantemente (traço azul). Após a estabilização do fluxo de oxigênio (traço vermelho) durante a respiração rotina de células intactas, oligomicina foi adicionada para inibir a F0F1-ATP sintase. Isto é indicado pela estabilização do fluxo de oxigênio após adição de oligomicina, que revela a respiração de vazamento. Aproximadamente 3-5 titulações de FCCP devem ser executadas para desacoplar a respiração de síntese de ATP e de revelar a capacidade de transporte de elétrons do sistema (ETS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: malsucedido desacoplamento da respiração de célula HepG2. Após adição de células, o oxigênio fluxo estabilizado (traço vermelho) durante a rotina respiração oxigênio concentração e continuamente diminuída (linha azul). Titulação da FCCP resultou em um desacoplamento incompleta e eventual inibição, impedindo que a capacidade máxima de ETS sendo atingido. Compararia provavelmente foi contaminada ou reduzida de armazenamento a longo prazo. Se observada, deve estar preparado um estoque de Compararia a fresco. Além disso, confirme que esse oligomicina não inibe a capacidade ETS durante o desacoplamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O objetivo do calorespirometry é avaliar quantitativamente as contribuições das vias aeróbias e anaeróbias, a atividade metabólica e obter uma visão composta de fluxo de energia celular. Isso é realizado por uma medida simultânea de dissipação de calor e fluxo de oxigênio, seguido por uma comparação do rácio CR calculado com o equivalente de oxycaloric teórica. Vários passos críticos devem ser considerados para dados reprodutíveis e confiáveis. A manutenção de uma cultura de pilha de estéril, saudável é fundamental. Contaminação por bactérias ou fungos pode resultar em consumo de produção ou oxigênio calor desviados, tornando a relação CR sem sentido. Conta de celular mais, impróprio, pobre amostra de mistura, ou células agrupadas também podem resultar em uma relação de CR imprecisa. Um passo crítico no que se refere a respirometer é a preparação da amostra adequada para que a injeção está abaixo de 50 µ l de volume. Este volume garante uma quantidade mínima de meio é deslocada da câmara e o consumo de oxigênio é corretamente atribuído a 2 x 106 células. Uma vez que a respiração rotina é observada, o protocolo proposto é compatível com duas titulações adicionais (oligomicina e FCCP), que iluminam o vazamento a respiração e capacidade ETS das mitocôndrias. Para esta aplicação, adição excessiva de Compararia pode inibir a respiração e evitar o fluxo máximo; Portanto, as titulações de pelo menos 3-5 devem ser realizadas antes de atingir a máxima respiração desacoplada.
Manutenção e calibração adequada do respirometer e do calorímetro é fundamental para calorespirometry. O protocolo de titulação para o consumo de oxigênio de fundo é altamente recomendado e é realizado com passo a passo titulações de ditionito de alcançar níveis de oxigênio diminuída dentro da câmara. Esta é uma medida essencial para confirmar câmaras hermeticamente seladas e corrigir para trás difusão de oxigênio para as câmaras, especialmente se as medições são realizadas em uma tensão baixa de oxigênio. Também, realizar um teste de agitador antes da adição de células pode fornecer informações sobre a capacidade de resposta do POS. Se a resposta é pobre ou o fluxo de oxigênio não é estável (Figura 2), serviço para o POS é necessária. Limpeza inadequada das câmaras respirometer pode deixar para trás valores residuais de inibidores ou uncouplers, que podem afetar experimentos subsequentes. Bolhas de ar na câmara selada também são capazes de interferir com as medições e podem ser introduzidas durante o fechamento da câmara ou durante a injeção de amostra se bolhas de ar estão presentes dentro da seringa. Protocolo do calorímetro é mais direto, mas também é suscetível a erros experimentais. Por exemplo, a selagem inadequada da ampola permitirá evaporação ocorra que massivamente muda o fluxo de calor.
Uma das limitações deste método é que nem todas as células podem ser cultivadas em suspensão e são muitas linhas de células aderentes ao substrato ou placa de cultura de células. A fim de realizar experiências, células anexadas tem que ser enzimaticamente desalojada da placa através do uso de agentes de dissociação como tripsina. Células neste estado não podem estar em fase de crescimento logarítmico e sua fisiologia pode ser alterada. Assim, análise subsequente através que do calorímetro e respirometer de células de reserva trypsinized podem avaliar interrompeu atividades celulares. Além disso, uma limitação no protocolo calorimétrica apresentada é a sedimentação das células em ampola fechadas, que podem levar a hipóxia local ao redor das células devido à difusão lenta de oxigênio em soluções aquosas. Nós determinamos que ~ 3 x 105 células é o limite superior compatível com as ampolas, utilizadas neste protocolo. Aumento do número de células pode gerar um ambiente hipóxico da sedimentação das células, comprometer os resultados. Assim, a otimização é fundamental se uma linhagem de células diferentes é investigada e abordagens alternativas devem ser consideradas como aumentar a densidade do meio para reduzir a sedimentação das células24. Ampolas são disponíveis essa autorização mexendo; no entanto, é fundamental para garantir que uma relação sinal-ruído mínima está presente durante a agitação. Além disso, aparelhos para mediação calorimétrica além daquele empregado no presente protocolo são compatíveis com calorespirometry e suas capacidades podem ser além do que apresentamos. Outra limitação de calorespirometric análise através de um respirometer duas câmaras é a incapacidade para uma análise de alta produtividade, que seria mais relevante para o desenvolvimento farmacêutico. Essa limitação, no entanto, é compensada pela capacidade para uma caracterização de alta resolução de influência do complexo da cadeia respiratória e fisiologia mitocondrial.
A capacidade de medição de alta resolução e simultânea do fluxo de oxigênio e saída de calor da mesma amostra é uma força significativa desse método. Um potencial padrão-ouro quando usando células aderentes seria para ambos cultura e analisar as células cultivadas em grânulos microcarrier em suspensão. Esse método seria evitar o impacto negativo da dissociação de superfície de cultura celular e permitem a análise das funções celulares em diferentes fases da curva de crescimento (fase logarítmica vs inibida pelo contato fase7). Infelizmente, usando microcarrier grânulos pode ser problemático devido à alta velocidade de agita necessária no respirometer e o potencial para moagem dos grânulos juntamente com células debaixo da barra de agitação. Apesar dessas limitações, uma ampla gama de aplicações permanece compatível com calorespirometry. Em particular, este método está preparado para melhor facilitar o desenvolvimento farmacêutico identificando rapidamente mitotoxic compostos em pilhas cultivadas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pela concessão do National Science Foundation-160944 para Mary E. Konkle e Michael A. Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
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