Evaluar el papel de la función mitocondrial en la fatiga relacionada con el cáncer
Summary
Nuestro objetivo era desarrollar un protocolo práctico para evaluar la disfunción mitocondrial asociada a fatiga en pacientes con cáncer. Este innovador protocolo está optimizado para uso clínico que implica flebotomía estándar y procedimientos básicos de laboratorio.
Abstract
La fatiga es común y debilitante condición que afecta a la mayoría de los pacientes cáncer. Hasta la fecha, restos de fatiga mal caracterizados con ningún diagnóstico prueba para medir objetivamente la severidad de esta condición. Aquí describimos un método optimizado para la evaluación de la función mitocondrial de PBMCs recogidos de pacientes fatigados. Usando un sistema compacto de flujo extracelular y secuencial inyección de inhibidores respiratorios, examinamos estado funcional mitocondrial PBMC midiendo el básica respiración mitocondrial, capacidad respiratoria y fenotipo de energía, que describe la vía preferida de energía para responder al estrés. PBMCs frescos están disponibles en el ajuste clínico mediante flebotomía estándar. El ensayo completo que se describe en este protocolo se puede completar en menos de 4 horas sin la participación de técnicas bioquímicas complejas. Además, se describe un método de normalización que es necesario para obtener datos reproducibles. Los métodos de procedimiento y normalización simple presentados permiten para recolección de muestras repetidas del mismo paciente y generación de datos reproducibles que pueden compararse entre puntos de tiempo para evaluar los efectos potenciales del tratamiento.
Introduction
La fatiga es una condición frecuente y angustiante que tiene un impacto negativo en la calidad de vida de pacientes de cáncer1. Hasta la fecha, fatiga del cáncer sigue siendo mal definida y se basa sólo en información subjetiva de pacientes2. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar una prueba de laboratorio de diagnóstico fácilmente adaptable para caracterizar objetivamente la fatiga en el ajuste clínico3,4.
Se han propuesto múltiples mecanismos subyacentes, incluyendo la disfunción de las mitocondrias, que causan fatiga5. Las mitocondrias son los orgánulos de potencia, ofreciendo el 95% de las necesidades de energía celular por fosforilación oxidativa y juegan un papel importante en la señalización de calcio, apoptosis, señalización inmune y regulación de otros de eventos de señalización intracelular6 . Por consiguiente, alteración bioenergética mitocondrial y defectos en la producción de energía pueden contribuir a la fatiga. Apoyando esta hipótesis, estudios anteriores han observado mutaciones en el ADN mitocondrial en pacientes con síndrome de fatiga crónica7. Aunque no está claro si el origen fisiopatológico de la fatiga se encuentra dentro del sistema nervioso central o periférico tejidos, como músculos esqueléticos8,9, no existe ningún método directo para valorar con precisión disfunción mitocondrial se relaciona con fatiga en células vivas, respiran.
Utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) para el estudio de la función mitocondrial ofrece varias ventajas. En primer lugar, PBMCs están disponibles en el ajuste clínico mediante flebotomía estándar y pueden ser aislados rápidamente utilizando técnicas de laboratorio básicas. En segundo lugar, la recogida de sangre es menos invasiva que recoger otros tejidos tales como una biopsia del músculo. Así, recogieron muestras de sangre pueden ser del mismo paciente repetidamente en el tiempo, que facilita la evaluación longitudinal de los efectos del tratamiento. Curiosamente, la función mitocondrial en PBMCs parece correlacionarse bien con estado mitocondrial renal en un modelo animal10. Además, las mitocondrias de la célula inmune se han utilizado como un proxy para la detección de cambios sistémicos en enfermedad diferentes condiciones11,12. Las mitocondrias en las células inmunes circulantes son particularmente sensibles a los cambios en las funciones inmunológicas e inmune señalización moléculas como citoquinas13,14,15. Por ejemplo, se ha observado que PBMCs de pacientes con enfermedades inflamatorias reumáticas agudas exhiben alta base oxígeno consumo14. En contraste, el consumo de oxígeno se redujo en PBMCs aisladas de pacientes con condiciones inflamatorias sistémicas incluyendo sepsis16. En condiciones inflamatorias, radicales libres producidos por las mitocondrias disfuncionales pueden contribuir al elevado estrés oxidativo y la inflamación prolongada17. El papel central de las mitocondrias en la producción de energía, así como en el estrés oxidativo sugiere la posible utilidad del uso de la función mitocondrial como un proxy para el estudio de la fatiga en pacientes de cáncer 13.
Estudios anteriores que examinan la función mitocondrial utilizan técnicas bioquímicas, medición de potencial de membrana mitocondrial o aislamiento de poblaciones celulares específicas que no pueden ser fácilmente adaptables en el ajuste clínico5, 14,18. En los últimos años, el desarrollo de ensayos de flujo extracelular ha permitido a los investigadores a fácilmente y con precisión examinar los cambios en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en respuesta a las inyecciones automatizadas de inhibidores respiratorios19,20 , 21 , 22. sin embargo, la mayoría de estos estudios está diseñada para tipos específicos de la célula y el gran formato de alto rendimiento puede no ser aplicable en un ajuste clínico. En este manuscrito, se describe un protocolo optimizado para examinar la función mitocondrial para uso clínico.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fatiga en pacientes con cáncer es una condición debilitante que no está bien definido o caracterizado1. Diagnóstico de fatiga se basa enteramente en informes subjetivos y no hay estándar actual de diagnóstico o tratamiento para esta condición, en gran parte debido a la falta de entendimiento en el pathobiology2. De los mecanismos propuestos que fatiga en pacientes con cáncer, deterioro de la función mitocondrial es uno de los caminos más terapéutico targetable…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio es apoyado completamente por la división de investigación intramuros del Instituto Nacional de enfermería investigación de los NIH, Bethesda, Maryland.
Materials
| CPT Mononuclear Cells Preparation Tube | BD Biosciences | 362761 | For isolating PBMCs following phlebotomy |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040 | For making growth media for PBMCs |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | For making growth media for PBMCs |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | For making growth media for PBMCs |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface |
| Seahorse XF Calibrant Solution | Agilent | 103059-000 | For hydrating cartridges |
| XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) | Agilent | 103022-100 | Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges |
| XF base media | Agilent | 103335-100 | For making XF assay media |
| 45% cell culture D-(+)-Glucose solution | Corning | 25-037-CI | For making XF assay media |
| Sodium pyruvate solution | Corning | 25-000-CI | For making XF assay media |
| L-glutamine solution | ThermoFisher | 25030081 | For making XF assay media |
| Seahorse XFp Mito Stress Test Kit | Agilent | 103010-100 | Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone |
| CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay | ThermoFisher | C35011 | For quantification of live cells and data normalization |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | S7802AEA | For measuring mitochondrial function in live cells |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) | BioTek | BTCYT5PV | For quantification of live cells and data normalization |
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