הרכבה מהירה, מדרגי וטעינה של חלבונים ביו, Immunostimulants לתוך Nanocarriers סינתטי מגוונות באמצעות פלאש Nanoprecipitation
Summary
ננו מספקות מנגנונים מגוונים של משלוח טיפולית מבוקרת מדע בסיסי ויישומים translational, אך ייצור שלהם לעתים קרובות דורשת מומחיות שאינו זמין במעבדות ביותר ביו. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור ייצור מדרגי של טעינת טיפוליות מגוונות nanocarriers התאספו עצמית באמצעות nanoprecipitation פלאש.
Abstract
ננו מציגים מגוון רחב של אפשרויות להתאמה אישית של מסירת מטענים מולקולרית יחיד ומשולבים ליישומים טיפוליים הדמיה מבוקרת. סגוליות מוגבר זה יכול להיות השלכות קליניות משמעותיות, כולל תופעות לוואי ירידה במינונים נמוכים עם מינון גבוה יותר. יתר על כן, בחיי עיר מיקוד אפנון מבוקר של תאים מסוים קבוצות משנה יכול לשפר את החקירות בתוך חוץ גופית ו ויוו התופעות ביולוגיים בסיסיים, לחקור את תפקוד התא. למרבה הצער, המומחיות הנדרשת בתחום הננומטרי המדע, כימיה, הנדסה לעיתים קרובות לאיסור מעבדות ללא ניסיון בתחומים אלה בדיית והתאמה של ננו-חומרים כלים החקירות שלהם או כלי הרכב שלהם אסטרטגיות טיפוליות. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים עבור סינתזה ו הרכבה מדרגי של מערכת רב תכליתי רעיל בלוק קופולימר נוטה היווצרות נתיישב וטעינה של כלי רכב הננומטרי ביו יישומים. Nanoprecipitation פלאש מוצג מתודולוגיה להרכבת מהירה מגוונות nanocarriers מ- poly(ethylene glycol) –bl-copolymers פולי (פרופילן גופרתי). פרוטוקולים אלה לאפשר מעבדות עם מגוון רחב של מומחיות ומשאבים כדי בקלות, reproducibly הרכיבו מערכות nanocarrier מתקדמות על היישומים שלהם. תכנון וביצוע של כלי נגינה אוטומטיות המעסיקה משאבת מזרק במהירות גבוהה כדי להקל על nanoprecipitation פלאש את התהליך, כדי לאפשר שליטה משופרת על אחידות, גודל, מורפולוגיה הטעינה של polymersome nanocarriers הוא תיאר.
Introduction
Nanocarriers לאפשר למסירה מבוקרת של מטען קטן, macromolecular, כולל ישויות פעיל כזה, אם לא אנקפסולציה, יהיה מאוד מתכלה או גם הידרופוביות עבור ניהול ויוו. של מורפולוגיות nanocarrier באופן קבוע מפוברק, מקביל ליפוזומים (הנקראת גם polymersomes) פולימריים שלפוחית מציעים את היכולת לטעון בו-זמנית הידרופיליות, הידרופובי מטען1,2. למרות יתרונם מבטיח, polymersomes הם עדיין נדירים יישומים קליניים נובע, בין השאר, מספר אתגרים מרכזיים בייצור שלהם. לשימוש קליני, ניסוחים polymersome צריכים להיעשות בקבוצות בקנה מידה גדול, סטרילי, ועקבית.
מספר טכניקות יכולות לשמש polymersomes טופס של קופולימר diblock, כגון poly(ethylene glycol) –בלוק-פולי (פרופילן גופרתי) (פג –bl– PPS), זה כוללות נפיצה הממס3, סרט דק התייבשות1 , 4, 5,מיקרופלואידיקה6והידרציה ישירה7. פיזור החומר הממיס כרוך פעמים זמן דגירה בנוכחות ממיסים אורגניים, אשר ייתכן denature כמה מטענים ביו, כמו חלבונים. התייבשות סרט דק אינו מציע שליטה polydispersity של polymersomes בנוי, הדורשות לעיתים קרובות ההבלטה יקרים ולגזול הטכניקות להשגת monodispersity מקובל. יתר על כן, הן microfluids והן הידרציה ישירה קשים לקנה המידה עבור אחסון ייצור גדולים יותר. שיטות ייצור שונות nanocarrier, nanoprecipitation פלאש (FNP) מציע את היכולת לבצע ניסוחים בקנה מידה גדול, לשחזור8,9,10. בעוד FNP נשמרה בעבר ניסוח של חלקיקים מוצקים-core, המעבדה שלנו הרחיבה לאחרונה את השימוש FNP לכלול היווצרות עקבית של מגוון פג –bl– PPS ננו-מבנה מורפולוגיות11, 12, כולל polymersomes11 ו- bicontinuous nanospheres12. מצאנו כי FNP היה מסוגל להרכיב ניסוחים monodisperse של polymersomes ללא צורך שחול, וכתוצאה מכך שערכי האינדקס polydispersity מעולה בהשוואה ללא-extruded polymersomes שהוקמה על ידי פיזור התייבשות, הממס סרט דק 11. nanospheres Bicontinuous, עם תחומים הידרופובי גדול שלהם, לא יכלו להיווצר על ידי התייבשות סרט דק, למרות ויוצרים תחת מספר תנאים הממס עם FNP12.
כאן, אנו מספקים תיאור מפורט לסינתזה של פג ה –bl– PPS diblock קופולימר משמש במבנה polymersome, מיקסר מטוסי (CIJ) impingement סגור המשמש FNP, FNP הפרוטוקול עצמו, ושל היישום של מערכת אוטומטית כדי להפחית את השתנות המשתמש. כלול מידע אודות אופן לחטא את מערכת מספיק כדי לייצר אנדוטוקסין ללא ניסוחים שימוש ויוו, נציג נתונים בדבר אפיון polymersomes הנוצרת על-ידי FNP. עם המידע הזה, הקוראים עם עניין ניצול polymersomes לעבודה במבחנה , ויוו יוכלו ליצור משלהם סטרילי, ניסוחים monodisperse. הקוראים עם ניסיון ניסוחים nanocarrier, עם מומחיות סינתזה פולימר יוכלו לבחון במהירות מערכות פולימר שלהם באמצעות FNP כחלופה אפשרית טכניקות ניסוח הנוכחי שלהם. בנוסף, הפרוטוקולים המתוארים במסמך זה עשוי לשמש ככלים חינוכיים על ניסוח של nanocarriers בקורסים מעבדות ננוטכנולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
סיפקנו הנחיות מפורטות הזיוף מהירה של polymersomes באמצעות PEG17–bl– PPS35-SH כמו קופולימר diblock. Vesicular polymersomes הם המורפולוגיה צבירה ראשוני שהתאסף באתר היחס הזה של פג הידרופיליות, משקל מולקולרי של בלוק PPS הידרופובי. כאשר impinged מספר פעמים, יש להם קוטר ויצרו polydispersity שמתאים polymersomes extruded דרך קרום…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו להכיר צוות ומכשור לתמוך מהמתקן ביולוגיה מבנית באוניברסיטת נורת’ווסטרן. התמיכה של ר. ה לוריא מקיף סרטן מרכז של אוניברסיטת נורת’ווסטרן, אוניברסיטת נורת’ווסטרן המתקנים מבניים ביולוגיה הוא הודה. גלאי אלקטרונים ישירה Gatan K2 נרכש בכספים המסופקים על ידי האיחוד ביו שיקגו עם תמיכה מקרנות סרל ב שיקגו הקהילה הקרן. אנו מודים גם את המתקנים הבאים באוניברסיטת נורת’ווסטרן: המתקן המדע קק השטח בין-תחומית, המתקן ביולוגיה מבנית, המתקן הביולוגי הדמיה, המרכז המתקדם הדמיה מולקולרית ו האנליטי של Bionanotechnology ציוד הליבה. מחקר זה נתמך על ידי המענק הלאומית למדע 1453576, מוסדות לאומיים של בריאות מנהל חדש חדשן פרס 1DP2HL132390-01, מרכז פרס Catalyst ננו-רפואה רגנרטיבית ופרס זרז מקורמיק 2014. SDA נתמך בחלקה על ידי NIH ביוטכנולוגיה predoctoral אימונים גראנט T32GM008449.
Materials
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
Referenzen
- Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
- Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O’Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
- Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
- Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
- Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
- O’Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
- Saad, W. S., Prud’homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302 (2003).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
- Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
- Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
- Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
- Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624 (2018).
- Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
- Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
- Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud’homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
- Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud’homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).
