Montaggio veloce e scalabile e caricamento di proteine bioattive e immunostimolanti in nanovettori diversi sintetici tramite Flash nanoprecipitazione
Summary
Nanomateriali forniscono meccanismi versatili di consegna controllata terapeutico per scienza di base e traslazionale applicazioni, ma spesso la loro fabbricazione richiede competenze che non sono disponibile in più biomedical laboratories. Qui, presentiamo i protocolli per la fabbricazione scalabile e terapeutico carico di diversi nanovettori auto-assemblati utilizzando flash nanoprecipitazione.
Abstract
Nanomateriali presentano una vasta gamma di opzioni per personalizzare il rilascio controllato di payload molecolare singolo e combinato per applicazioni terapeutiche e imaging. Questa specificità aumentata può avere implicazioni cliniche significative, tra cui una riduzione di effetti collaterali e i dosaggi più bassi con potenza superiore. Inoltre, in situ di mira e modulazione controllata dei sottoinsiemi delle cellule specifiche può migliorare le indagini in vitro e in vivo dei fenomeni biologici fondamentali e sonda la funzione delle cellule. Purtroppo, le competenze necessarie in nanoscala scienza, chimica e ingegneria spesso vietare laboratori senza esperienza in questi campi da fabbricare e personalizzazione dei nanomateriali come strumenti per i loro studi o veicoli per loro strategie terapeutiche. Qui, forniamo i protocolli per la sintesi e l’assemblaggio scalabile di un sistema di copolimero versatile non tossico blocco suscettibile alla formazione facile e carico di veicoli su scala nanometrica per applicazioni biomediche. Flash nanoprecipitazione si presenta come una metodologia per la fabbricazione rapida di nanovettori varia da poly(ethylene glycol) –bl-copolimeri di poly (solfuro di propilene). Questi protocolli permetterà laboratori con una vasta gamma di competenze e risorse per facilmente e riproducibile fabbricare nanocarrier avanzati sistemi di consegna per le loro applicazioni. Processo di progettazione e costruzione di uno strumento automatizzato che impiega una pompa a siringa ad alta velocità per facilitare la nanoprecipitazione flash e per consentire un controllo maggiore sull’omogeneità, dimensione, morfologia e caricamento dei nanovettori polymersome è descritto.
Introduction
Nanovettori consentono per la consegna controllata di merci piccole e macromolecolare, tra cui entità attive che, se non incapsulato, sarebbe troppo idrofobico per somministrazione in vivoe/o altamente degradabili. Delle morfologie di nanocarrier regolarmente fabbricate, polimeriche vescicole analoghe a liposomi (chiamati anche polymersomes) offrono la possibilità di caricare contemporaneamente idrofile e idrofobe cargo1,2. Malgrado i loro vantaggi promettenti, sono ancora rari in applicazioni cliniche polymersomes dovuta, in parte, alle diverse sfide chiave nella loro produzione. Per uso clinico, polymersome formulazioni devono essere effettuate in batch su vasta scala, sterile e coerente.
Una serie di tecniche può essere utilizzato per polymersomes forma da un copolimero diblock, ad esempio poly(ethylene glycol) –block-poli (solfuro di propilene) (PEG –bl– PPS), che includono dispersione solvente3, film sottile reidratazione1 , 4, microfluidica 5,6e idratazione diretta7. Dispersione di solvente comporta tempi di incubazione lungo in presenza di solventi organici, che possono denaturare alcuni payload bioattivi, come le proteine. Reidratazione di film sottile non offrono controllo sopra la polidispersità del formato polymersomes, spesso richiedono tecniche di estrusione costoso e richiede tempo per ottenere monodispersity accettabile. Inoltre, sia microfluidica e idratazione diretta sono difficili da scala per grandi volumi di produzione. Dei metodi di fabbricazione diversi nanocarrier, flash nanoprecipitazione (FNP) offre la possibilità di fare su larga scala e riproducibile formulazioni8,9,10. Mentre FNP precedentemente era riservata per la formulazione di nanoparticelle solid-core, il nostro laboratorio ha recentemente esteso l’utilizzo di FNP per includere la costante formazione di diversi PEG –bl– PPS nanostruttura morfologie11, 12, tra cui polymersomes11 e bicontinue nanosfere12. Abbiamo trovato che FNP era in grado di formare monodispersi formulazioni di polymersomes senza la necessità di estrusione, determinando i valori di indice di polidispersione superiore rispetto ai non-estruso polymersomes formata da dispersione di reidratazione e solvente di film sottile 11. bicontinue nanosfere, con loro grande domini idrofobici, non erano in grado di essere formata da reidratazione di film sottile, nonostante la formazione nell’ambito di una serie di condizioni solvente con FNP12.
Qui, forniamo una descrizione dettagliata per la sintesi di PEG –bl– PPS diblock Copolimero utilizzato nella formazione di polymersome, il mixer di getti (CIJ) di impingement confinati utilizzato per FNP, il FNP protocollo stesso e l’applicazione di un sistema automatizzato per ridurre la variabilità di utente. Sono disponibili informazioni su come sterilizzare il sistema sufficientemente per produrre privo di endotossina formulazioni per uso in vivoe dati rappresentativi riguardanti la caratterizzazione di polymersomes formata da FNP. Con queste informazioni, i lettori con interesse che utilizza polymersomes per lavoro in vitro e in vivo saranno in grado di fabbricare le proprie formulazioni monodispersi sterile. Lettori con esperienza nelle formulazioni di nanocarrier e con competenze di sintesi del polimero sarà in grado di testare rapidamente i propri sistemi di polimero usando FNP come un’alternativa potenziale alle loro tecniche di formulazione attuale. Inoltre, i protocolli descritti nel presente documento possono essere utilizzati come strumenti didattici per la formulazione dei nanovettori in corsi di laboratorio di nanotecnologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo fornito dettagliate istruzioni per la realizzazione rapida di polymersomes utilizzando PEG17–bl– PPS35-SH come il copolimero diblock. Polymersomes vescicolare sono la morfologia di aggregata primaria assemblata con questa proporzione di PEG idrofili e idrofobi PPS blocco molecolare peso. Quando impinged più volte, hanno un diametro e polidispersità che corrisponde polymersomes estruso attraverso una membrana nm 200 dopo essere stata formata tramite idratazione a film sott…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo che il personale e strumentazione sostiene provenienti dall’impianto di biologia strutturale alla Northwestern University. Il supporto dall’U.R. Lurie completa cancro centro della Northwestern University e le strutture di biologia strutturale Università nordoccidentale è riconosciuto. Il rivelatore di elettroni diretto Gatan K2 è stato acquistato con i fondi forniti dal Consorzio biomedica di Chicago con il supporto dei fondi Searle a The Chicago comunità Trust. Ringraziamo anche i seguenti servizi presso la Northwestern University: il laboratorio di Scienze Keck superficie interdisciplinare, la funzione di biologia strutturale, la struttura biologica di Imaging, il Center for Advanced Imaging molecolare e analitica Bionanotecnologia attrezzature Core. Questa ricerca è stata sostenuta dalla concessione della National Science Foundation 1453576, istituti nazionali di salute direttore nuovo Innovator Award 1DP2HL132390-01, il Center for rigenerativa nanomedicina Catalyst Award e il premio di catalizzatore McCormick 2014. SDA è stato in parte sostenuto da NIH predoctoral biotecnologia Training Grant T32GM008449.
Materials
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
Referenzen
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