JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Umwelt

Гибкие низкая стоимость гидропоники системы для оценки реакция растений на небольших молекул в стерильных условиях

Published: August 25, 2018
doi:
10.3791/57800
, , , , , ,
1Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE),Brazilian Center for Research in energy and materials (CNPEM), 2University of Campinas (UNICAMP), 3University of Viçosa (UFV), 4CTBE,CNPEM, 5Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE/CNPEM),Max Planck Partner Group

Summary

Простой, универсальный и недорогой в vitro гидропоники системы успешно была оптимизирована, позволяя широкомасштабных экспериментов в стерильных условиях. Эта система облегчает применение химических веществ в растворе и их эффективного поглощения корнями для молекулярной, биохимических и физиологических исследований.

Abstract

Широкий спектр исследований в биологии растений выполняются с использованием гидропоники культур. В этой работе представлен в vitro гидропоники роста система, предназначенная для оценки реакция растений на химических и других веществ, представляющих интерес. Эта система очень эффективна в получении однородной и здоровые саженцы C3 и C4 модели видов Arabidopsis thaliana и Setaria зелёный, соответственно. Стерильные культивирования избегает водорослей и микроорганизмов загрязнения, которые известны ограничивающих факторов для нормального роста и развития растений в гидропонике. Кроме того эта система является масштабируемой, позволяя урожая растительного материала в крупных масштабах с незначительных механических повреждений, а также урожай отдельных частей растения, при желании. Подробный протокол, демонстрируя, что эта система имеет сборку простой и недорогой, как он использует пипеткой стойки в качестве основной платформы для выращивания растений, предоставляется. Возможности этой системы была проверена с помощью Arabidopsis саженцы оценить эффект препарата АЗД-8055, химического ингибитор целевого объекта киназы rapamycin (TOR). Ингибирование TOR эффективно обнаружена 30 мин в кратчайшие сроки после лечения АЗД-8055 в корни и побеги. Кроме того АЗД-8055-лечение растений отображается ожидаемых крахмала избыток фенотип. Мы предложили эту гидропоники системы как идеальный метод для исследователей завод стремится контролировать действия индукторов растений или ингибиторы, а также оценить метаболизм потоков с использованием изотопов маркировки соединений, которые, в целом, требует использования дорогих реагентов.

Introduction

Преимущества выращивания растений с использованием гидропоники широко признается в производстве больших и форма растений, позволяя воспроизводимость экспериментов1,2,3. В этой системе состав питательный раствор можно должным образом контролируется и переработанных вдоль всех стадиях роста и развития растений. Кроме того корни не подвергаются к абиотическим стрессам, как может случиться в почвы выращенных растений, таких как питательных голода и воды дефицит4. Как растения, выращенные гидропоники настоящий Морфологические и физиологические черты, довольно похож на те, которые выращиваются в почве эта система широко использовалась в исследованиях потому, что она позволяет осуществлять мониторинг роста корня/стрелять и их заготовки без травмы2,5.

Благодаря возможности изменения состава и концентрации раствора питательная большинство исследований с использованием гидропоники условий выполнено охарактеризовать функции микро – и макроэлементы1,3 ,6,,78. Однако эта система оказалась очень полезной для широкого круга приложений в биологии растений, таким образом, чтобы уточнить функции гормонов и химических веществ в растениях. Например открытие strigolactones как новый класс гормонов9 и фенотип ускоренного роста, вызванного Брассиностероиды приложения10 были исполнены в гидропонных условиях. Кроме того, эта система позволяет эксперименты с метками изотопов (например, 14N /15N и 13CO2)11,12 , чтобы оценить их включению в белков и метаболитов по масс-спектрометрии.

Учитывая важность этой системы в исследования растений, большое количество гидропонных культур был разработан в последние несколько лет, включая системы, использующие (i) передача саженцев из плит для гидропоники контейнеры3, 13; (ii) минеральная вата, которая ограничивает доступ к на ранних стадиях корень развития2,,1415; (iii) полиэтилена гранулят как плавающий органа, который делает однородной применение малых молекул/лечение трудным16; или (iv) уменьшенное количество растений9,17. Обычно большой объем гидропонных танков, описаны во многих из этих протоколов (небольшие объемы, начиная от 1-5 L, до 32 Л)18, что делает применение химических веществ чрезвычайно дорогим. Хотя некоторые исследования описывают гидропоники выращивания в асептических условиях8,19, Ассамблея системы обычно довольно трудоемким, состоящий из идеальный регулировки нейлоновые сетки в пластика или стекла контейнеры5,8,17,20.

Ввиду важности Arabidopsis thaliana как модель завод большинство гидропоники системы были разработаны для этого вида1,2,8,14,18, 19 , 20. Тем не менее, есть несколько исследований, отчетности гидропоники роста функции других видов растений с помощью предварительной обработки семян для улучшения их всхожесть и синхронизации ставки в vitro8,16 . Для работы в больших масштабах, мы разработали протокол для создания простых и недорогостоящих обслуживания гидропоники системы, которая обеспечивает стерильные условия для выращивания растений, в том числе A. thaliana и другие виды, такие как трава Щетинник Зелёный. Метод, описанный здесь подходит для различных экспериментов, как рост рассады можно развернуть, синхронизации и легко контролируется. Кроме того, эта система имеет много преимуществ, как: (i) его Ассамблее прост и может быть повторно использован его компонентов; (ii) оно позволяет легко применение различных химических веществ в жидкой среде; (iii саженцев прорастают и расти непосредственно в среде культуры без необходимости перехода к системе гидропоники; (iv) стрелять и корень развития/рост может тесно контролироваться и саженцы собирают без ущерба; и (v), это делает его возможным для работы на больших масштабах, поддержания физиологических условиях.

Protocol

1. Подготовка жидких и твердых культуры и средств массовой информации Подготовить жидкой среды, используя половину сила фотосинтетическую и Скуг (МС) средний с витаминами [0,0125 мг/Л cobalt(II) хлорид пентагидрат, 0,0125 мг/Л Небходимая сульфата пентагидрат, 18,35 мг/Л тетранатрия железа натри?…

Representative Results

Киназы TOR является основной регулятор, который интегрирует питательных веществ и энергии, сигнализации способствовать пролиферации клеток и рост всех эукариот. Усилия по разъяснению функций TOR в растениях включают поколения Arabidopsis трансгенных линий, содержащих ?…

Discussion

Эта оптимизированная гидропонных структура позволяет культуры успешным в vitro растений. Семена прорастают на твердой питательной на плоской поверхности наконечник пипетки, значительный прирост по сравнению с системами, где семена замачивают с питательным раствором. Большим преи?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана в Сан-Паулу исследовательский фонд (FAPESP; Предоставить 12/19561-0) и Общество Макса Планка. Элиас F. Араужо (FAPEMIG 14/30594), Каролина C. Монте Белло (FAPESP; Грант 10407/14-3), Валерия Mafra (FAPESP; Грант 14/07918-6), и благодарны за стипендии Вивиан C. H. да Силва (накидки/CNPEM 24/2013). Авторы благодарят Кристиан Мейер из Института Жан Пьер Bourgin (ИПРА, Версаль, Франция) за щедро предоставленные антител против RPS6. Авторы благодарят RTV UNICAMP и Эд Паулу Апареси́до де Соуза Маноэль за их техническую поддержку в ходе аудио записи.

Materials

Ethanol Merck 100983
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Polysorbate 20   Sigma-Aldrich P2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins  Duchefa Biochemie M0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Duchefa Biochemie M1503
Agar  Sigma-Aldrich A7921
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 484016
Laminar flow hood Telstar BH-100
Hotplate AREC F20510011
Growth chamber Weiss Technik HGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) Uniglass 189.006
200 μL pipette tip racks  Kasvi K8-200-5 *
300 μL multichannel pipette Eppendorf 3122000060
300 μL pipette tips Eppendorf 30073088
200 μL pipette  Eppendorf 3120000054
200 μL pipette tips Eppendorf 30000870
Scissors Tramontina 25912/108
Tweezer ABC Instrumentos 702915
Scalpel blade Sigma-Aldrich S2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m) Scotch 3M 5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) Maxipac 32771
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
  2. Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
  3. Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
  4. Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
  5. Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
  6. Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
  7. Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
  8. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
  9. Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
  10. Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
  11. Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
  12. Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
  13. Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O., Asao, T. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. , 135-152 (2012).
  14. Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
  15. Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
  16. Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
  17. Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
  18. Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
  19. Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
  20. Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
  21. Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
  22. Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
  23. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
  24. Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
  25. Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
  26. Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
  27. Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W., Fleischer, S., Fleischer, B. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. 174, 518-552 (1989).
  28. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
  29. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  30. Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR?. Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
  31. Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
  32. Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
  33. Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
  34. Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
  35. Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
  36. Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
  37. Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
  38. Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
  39. Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
  40. Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
  41. Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
  42. Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
  43. Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
  44. Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
  45. Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
  46. Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
  47. Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
  48. Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
  49. Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  50. Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
  51. Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
  52. Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
  53. Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
  54. Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
  55. Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
  56. Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
  57. Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).

Tags

Keywords: Hydroponic SystemIn VitroSterile ConditionsPlant ResponsesSmall MoleculesArabidopsis ThalianaMS MediumLaminar Flow HoodSterilizationUV LightSolid MediumLiquid Medium
check_url/de/57800?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F., Martins, M. C., Mafra, V., da Silva, V. C., Celente, V., Caldana, C. A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57800, doi:10.3791/57800 (2018).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image