JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Automatische Übersetzung
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemie

Определение Hsp33 в редокс регулируемых Chaperone активность и сопоставления конформационные изменения на Hsp33 с использованием водорода дейтерия обмен масс-спектрометрия

Published: June 07, 2018
doi:
10.3791/57806
, , ,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Один из самых сложных условиях стресса, которые организмов столкнуться во время их жизни предполагает накопление окислителей. Во время окислительного стресса клетки сильно полагаться на молекулярных сопровождающим. Здесь мы представляем методы, используемые для расследования редокс регулируемых анти агрегационной активности, а также мониторирование структурные изменения, регулирующие функции сопровождения, с помощью HDX-МС.

Abstract

Живые организмы должны регулярно справляться с колебаниями среды в течение их жизненного цикла, включая изменения температуры, рН, накопление реактивнооксигенных видов, и многое другое. Эти колебания могут привести к широко белка разворачивается, агрегации и смерть клетки. Таким образом клетки развивались динамичной и стресс конкретных сеть молекулярной сопровождающих, которые поддерживают «здоровой» протеома в условиях стресса. ATP-независимые сопровождающих представляют собой один из основных класса молекулярной сопровождающих, которые служат в качестве первой линии обороны молекул, защита против агрегации белков в зависимости от стресса. Одна особенность, которую эти сопровождающих имеют в общем является их способность использовать структурные пластичности для их активации стресс конкретных, признание и выпуска смятых клиента.

В этой статье мы ориентируемся на функциональный и структурный анализ одной такой неразрывно неупорядоченных сопровождающий, бактериальных редокс регулируется Hsp33, который защищает белки против агрегации во время окислительного стресса. Здесь мы представляем набор инструментов различных методов для изучения редокс регулируемых сопровождения деятельности, а также для картирования конформационные изменения шаперонов, лежащие в основе его деятельности. В частности, мы описываем процесс, который включает в себя подготовку полностью уменьшается и полностью окисляется белков, следуют анализ сопровождающий анти агрегационной активности в пробирке с помощью светорассеивающего, сосредоточив внимание на степень анти агрегационной активности и его кинетики. Чтобы преодолеть частые промахи, накопленных в ходе статистических анализов, мы описывают использование Kfits, Роман графический инструмент, который позволяет легко обрабатывать кинетическими измерениями. Этот инструмент легко может применяться к другим типам Кинетические измерения для удаления промахов и установка кинетических параметров. Чтобы сопоставить функции с структуры белков, мы описывают установки и процесса структурной масс-спектрометрии техники, водорода дейтерия обмен масс-спектрометрии, что позволяет отображение конформационные изменения на сопровождающий и субстрат в ходе различных этапов деятельности Hsp33. Та же методология может применяться для других взаимодействий протеин протеина и белка лиганд.

Introduction

Клетки часто сталкиваются накопление реактивнооксигенных видов (ров) производится как побочные продукты дыхания1,2, белков и липидов окисления3,4и дополнительные процессы5, 6,7. Несмотря на РОСИ благотворную роль в различных биологических процессах, таких как сотовые сигнализации8,9 и иммунный ответ10дисбаланс между производством рос и его детоксикации может произойти, ведущих к окислительным подчеркнуть7. Биологической цели ROS являются белки, липиды и нуклеиновые кислоты, окисления, которые влияют на их структуру и функции. Таким образом накопление сотовой окислителей тесно связан с разнообразных патологий, включая рак9,11, воспаление12,13и старения14, 15и были найдены в наступление и прогрессии нейродегенеративных расстройств, таких как Альцгеймера, Паркинсона и ALS болезнь16,17,18.

Недавно синтезированных и зрелые белки очень чувствительны к окислению ввиду потенциально опасные изменения их боковых цепей, которые формируют протеин структуры и функции19,20. Таким образом Оксидативный стресс обычно приводит к инактивации широко белка, сворачиванию и агрегирования, в конечном итоге приводит к смерти клетки. Один из элегантных сотовой стратегии, чтобы справиться с потенциальным ущербом окисление белков является использовать редокс зависимых сопровождающих, которые препятствуют широко белка агрегации, вместо формирования стабильные комплексы с клиента смятых протеинов21 ,,22–23. Эти первой линии обороны сопровождающих быстро активируются по участкам окисления (обычно на остатков цистеина), который преобразует их в мощный анти агрегирование молекул24. Так как Оксидативный стресс приводит в угнетение дыхания и уменьшается в клеточных уровни ATP25, каноническое АТФ зависимые сопровождающих являются менее эффективными при окислительном стрессе условий25,26 ,27. Таким образом, редокс активации АТФ независимые сопровождающих играют жизненно важную роль в поддержании гомеостаза белка после накопления окислителей в бактерий и эукариот (например, Hsp3328 и29 Рида в бактерии, Get330 в peroxiredoxins31 в клетках эукариот: у дрожжей). Деятельность этих сопровождающих сильно зависит от реверсивные конформационные структурных изменений, вызванных участкам окисления, что раскрывает гидрофобные регионы вовлеченных в признании клиента смятых протеинов.

Исследование механизма борьбы с агрегации и принципы, регулирующие признание клиента белков, сопровождающих не легко из-за динамичного и разнообразного характера шаперонов субстрат взаимодействия32,33, 34,35,,3637. Однако, стресс регулируется сопровождающим имеют возможность для продвижения нашего понимания анти статистическую функцию из-за их способность: 1) получить две различные формы сопровождающий, активно (например, окисляется) и неактивных (например, сокращены), с введения или удаления состояния стресса, легко переключаться между ними (например, окислителя и восстановителя), 2) имеют широкий спектр субстратов, 3) образуют весьма стабильные комплексы с клиента белков, которые могут быть оценены различные структурные методологии и 4) сосредоточиться исключительно на признания субстрата и релиз, посредничестве редокс зависимых конформационные изменения, как большинство из этих сопровождающих не хватает складной возможности.

Здесь мы анализируем бактериальных редокс регулируемых сопровождающий Hsp33 в борьбе с агрегационной активности, жизненно важным компонентом системы бактериальной обороны против окисления индуцированного белка агрегации28. При уменьшении Hsp33 это плотно сложенный цинка связывающий белок с без сопровождения деятельности; Однако когда подвергается окислительному стрессу, Hsp33 проходит обширные конформационные изменения, которые предоставляют его субстрат привязки регионов38,39. После окисления иона цинка, который сильно привязан к четыре высоко сохранены хвоща остатков домена C-терминала — выпустила40. Это приводит к образованию двумя дисульфидными облигаций, разворачивается домен C-терминала и дестабилизации соседних компоновщика региона41. C-терминала и компоновщик регионы являются очень гибкими и определяются как частично или внутренне неупорядоченным. По возвращении в не стрессовых условиях которым стало сокращение и шаперонов возвращается в свой родной сложенном состоянии с не анти агрегационной активности. Складывая шаперонов приводит к дальнейшей разворачивается и дестабилизации белка присоединенного клиента, который вызывает его передачи канонической сопровождения системы, DnaK/J, складывая38. Анализ сайтов взаимодействия Hsp33 и предполагает, что Hsp33 использует оба его заряженных неупорядоченных регионов, а также гидрофобные регионов на компоновщик и N-концевой домен для захвата денатурации белков клиента и предотвратить их агрегации38, 42. в сложенном состоянии, эти регионы являются скрытыми сложенном компоновщик и домен C-терминала. Интересно, что компоновщик региона служит привратник Hsp33 в сложенном и неактивные государства, «зондирования» складной статус его рядом C-терминала домен34. Когда дестабилизирована мутагенеза, (либо Точечная мутация или полной последовательности возмущений), Hsp33 преобразуется в конститутивно активных сопровождающий независимо окислительно-восстановительного состояния его редокс чувствительных к которым43.

Здесь представлены протоколы позволяют мониторинг Hsp33 в редокс зависимых сопровождения деятельности, а также картирование конформационные изменения после активации и привязка клиента белков. Эта методология может быть адаптирована для исследования других шаперонов клиент признание моделей, а также не сопровождающий белок белковых взаимодействий. Кроме того мы представляем протоколы для подготовки полностью восстановленного и окисленного сопровождающих, которые могут использоваться в исследованиях других белков редокс переключатель, чтобы выявить потенциальную роль окисление белков на активность белка.

В частности, мы описывают процедуру мониторинга сопровождения деятельности в пробирке и определить его субстратная специфичность под различные типы агрегации белков (химически и термически индуцированной) рассеяния света (LS) измеряется с помощью fluorospectrometer44. В ходе статистической обработки рассеяние света на 360 Нм увеличивается быстро из-за увеличения мутность. Таким образом в зависимости от времени на этой длине волны может контролироваться агрегации. LS — это быстрый и чувствительных метод для тестирования агрегации белков и, таким образом, анти агрегационной активности белка интерес с помощью наномолярных концентрациях, позволяя характеристику белков связанных с агрегации кинетических параметров при различных условий. Кроме того протокол LS, описанный здесь не требуют дорогостоящей аппаратуры и может быть легко устанавливается в любой лаборатории.

Тем не менее это довольно сложной задачей для получения «чистой» кинетических кривых и получения белка кинетических параметров от таких светорассеянию эксперименты, из-за шума и большое количество промахов, порожденных пузырьки воздуха и крупных агрегатов. Чтобы преодолеть это препятствие, мы представляем новый графический инструмент, Kfits45, используется для снижения уровня шума в разных Кинетические измерения, специально приспособлены для белка агрегации кинетических данных. Это программное обеспечение обеспечивает предварительные кинетические параметры для ранней оценки результатов и позволяет пользователю «чистых» больших объемов данных быстро не затрагивая его кинетические свойства. Kfits , реализованных в Python и доступны в открытым исходным кодом на 45.

Один из сложных вопросов в области относится сопоставление сайтов взаимодействия между их клиент белков и сопровождающих и понимания, как сопровождающим признать широкий спектр смятых субстратов. Этот вопрос далее осложняется, когда изучение высокодинамичные белковых комплексов, которые неразрывно связаны неупорядоченных сопровождающих и подверженных агрегации субстратов. К счастью структурные масс-спектрометрии значительно продвинулась в течение последнего десятилетия и успешно оказывает полезные подходы и инструменты для анализа структурных пластичности и карта остатков занимающихся белка признание46, 47 , 48 , 49. здесь, мы представляем один такой техники водород дейтерий обмен масс-спектрометрии (HDX-МС)-которая позволяет отображение остаточного уровня изменения в структурной конформации белка модификации или белка/лигандом привязки35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS использует непрерывного обмена водороды позвоночника от дейтерия, уровень которой зависит от химической среды, доступность, и ковалентных и ковалентные связи56. HDX-MS отслеживает эти обменные процессы, с помощью транс растворителя, часто тяжелой воды (D2O) и позволяет измерения, основанные на изменении молекулярной массой после водорода дейтерия обмена. Замедление темпов обмена водорода дейтерия может привести от водороды участвующих в водородных связей или, просто, от их пространственной помех, который показывает локальных изменений в структуре57. Изменения на Связывание лиганда или столб-поступательные изменения также могут привести к различия в среде водорода с помощью привязки, что привело к различиям в водорода дейтерия обмен (HDX) ставки46,53.

Мы применили эту технологию к 1) карта Hsp33 регионов, которые быстро разворачиваться после окисления, приводит к активации Hsp33 и 2) определить потенциальные привязки интерфейс Hsp33 с его полнометражный смятых субстрата, цитрат синтазы (CS)38.

Методы, описанные в этой рукописи могут применяться к исследованию редокс зависимые функции белков в пробирке, определение анти агрегационной активности и роль структурных изменений (если таковые имеются) в функции протеина. Эти методики могут быть легко адаптированы различных биологических систем и применяется в лабораторных условиях.

Protocol

1. Подготовка полностью уменьшается и полностью окисляется белков Подготовка полностью снижение белкаПримечание: Здесь мы описываем сокращение цинка содержащих белков и использование ZnCl2 решения для восстановления состояния Zn инкорпорейтид, снижение белка. ZnCl<…

Representative Results

Представлены два метода позволяют следовать кинетическая активности и динамики белковых взаимодействий между сопровождающий и его субстрата. Кроме того уменьшение окисления протокол позволяет подготовку полностью уменьшается и полностью окисляется сопровождающи…

Discussion

В этой статье мы предоставили протоколы для анализа деятельности сопровождающий редокс зависимых и характеристика структурных изменений после привязки клиента белка. Они являются взаимодополняющими методологии для определения потенциальных шаперонов субстрат комплексов и анализи…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарны Meytal Радзински за ее полезные обсуждения и критических чтении этой статьи и Патрик Гриффин и членов его лаборатории для их неограниченной помощи при установлении HDX анализ платформы. Авторы благодарны немецко-Израиль фонд (I-2332-1149.9/2012), двусторонней научный фонд (2015056), Мари Кюри интеграции Грант (618806), научный фонд Израиля (1765/13 и 2629/16) и человека пограничной науки Программа (CDA00064/2014) за их финансовую поддержку.

Materials

Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. . Free radicals in biology and medicine. , (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes – an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry – a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemie. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Tags

Keywords: Hsp33Chaperone ActivityHydrogen-deuterium ExchangeMass SpectrometryOxidative StressProtein AggregationProtein DynamicsEnzyme InteractionsVisual Demonstration
check_url/de/57806?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33’s Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image