Analisi di N- glicani da Raphanus sativus cultivar utilizzando PNGasi H+
Summary
Descriviamo un metodo semplice e veloce per la preparazione e l’analisi di N– glicani da diverse cultivar di ravanello (Raphanus sativus).
Abstract
Negli ultimi anni, le moiety carboidrati delle piante hanno ricevuto una notevole attenzione, sono una fonte potenziale di cross-reattivi, provocando Allergia risposte immunitarie. Inoltre, strutture di carboidrati anche giocare un ruolo critico nel metabolismo vegetale. Qui, presentiamo un metodo semplice e veloce per la preparazione e l’analisi di N– glicani da diverse cultivar di ravanello (Raphanus sativus) usando un N– glycanase specifici per il rilascio delle strutture di carboidrati vegetali. Per raggiungere questo obiettivo, greggio acido tricloroacetico precipitati di ravanello omogeneati erano trattati con PNGasi H+ed etichettati utilizzando 2-aminobenzamide come un tag fluorescente. Con etichetta N– glycan campioni sono stati successivamente analizzati da altissime prestazioni cromatografia liquida (UPLC) separazione e matrix-assisted laser desorption ionizzazione-tempo di spettrometria di massa (MALDI-TOF) volo per una dettagliata strutturale valutazione e di quantificare il relativo abundancies di ravanello-derivati N– glycan strutture. Questo protocollo può essere utilizzato anche per l’analisi di N– glicani da varie altre specie di piante e può essere utile per ulteriori indagini della funzione e gli effetti di N– glicani sulla salute umana.
Introduction
N– glicani in piante hanno attirato l’attenzione aumentata negli ultimi anni, come la ricerca precedente ha evidenziato N– glicani come una potenziale fonte di reazioni crociate immunologiche che può provocare reazioni allergiche1,2 . È stato dimostrato in precedenza che N– glicani su glicoproteine vegetali può influire sulle attività catalitica3,4, termostabilità e pieghevole5,6 o localizzazione subcellulare e secrezione7. Al fine di correlare le strutture glycan con le rispettive funzioni, N– glicani deve essere rilasciata prima da glicoproteine chimicamente o enzimaticamente. Il classico metodo chimico per il rilascio di N– e O– glicani è β-eliminazione, in cui il trattamento alcalino campione è accompagnata da riduzione con boroidruro di cedere un alditol8. Tuttavia, questa procedura preclude etichettatura con un fluoroforo e causa decadimento significativo di unità monosaccaridiche dall’estremità riducente della struttura glycan. Deglycosylation chimico basato su carbonato di ammonio idrossido/trattamento è anche un metodo alternativo comunemente usato9. Nessuno di questi metodi di rilascio chimico degrada le proteine intatte, che permette l’analisi di spettrometria di massa di adenoide glycan piscine senza l’interferenza di frammenti peptidici nello stesso intervallo di massa. Tuttavia, uno svantaggio di questi metodi è il tasso di degradazione aumentata di α1, 3-fucosylated N– glicani, una struttura comune di carboidrato trovata in piante10. In alternativa, i metodi di rilascio enzimatico utilizzando peptide:N– glycanases (PNGases, CE 3.5.1.52) sono anche ampiamente applicato. Ricombinante PNGasi F (da Flavobacterium meningosepticum) è la scelta più comune e permetta la liberazione di tutti i tipi di N– glicani, tranne le strutture recanti un nucleo α1, fucosio 311,12. Pertanto, PNGasi A (isolato da semi di mandorla) viene solitamente utilizzato per l’analisi della pianta N– glicani13. Tuttavia, questo enzima deglycosylates solo proteoliticamente-derivati glicopeptidi ed è in grado di deglycosylate nativo glicoproteine14. Quindi, un workup di multi-step campione è richiesto prima di ulteriori analisi, che provoca perdita di glicani, specialmente quelli di abbondanza bassa15. L’obiettivo generale del metodo è di presentare un workflow ottimizzato per N– glycan rilascio e fluorescenza etichettatura in modo semplice e robusto. La logica sottostante è che PNGasi H+, che è stato recentemente scoperto in Terriglobus roseus e può essere recombinantly espresso in e. coli, possono idrolizzare N– glicani direttamente dal patibolo della proteina in acidi condizioni16. Un vantaggio chiave di utilizzo rispetto ai metodi alternativi di PNGasi H+ è che le reazioni d’etichettatura fluorescente possono essere eseguite nello stesso tubo di reazione senza modificare il buffer di reazione17,18. Le condizioni di preparazione semplice e alto recupero di basso-abbondanza oligosaccaridi fanno di questo metodo un prezioso strumento nell’analisi di N– glicani. Questo protocollo è adatto per l’analisi di N– glicani da varie specie di piante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo che abbiamo presentato qui consente il confronto dei profili N– glycan di varie cultivar di ravanello. Un notevole vantaggio di questo metodo rispetto ai protocolli esistenti è che è necessaria alcuna modifica di buffer tra il rilascio enzimatico di N– glicani e la reazione di derivatizzazione con 2-AB. Il punto più critico di questa procedura è la purificazione di N– glicani utilizzando la colonna SPE, come la mancata rimozione di sali o altre impurità nella miscela di reazi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte dalla Natural Science Foundation of China (concedere numeri 31471703, A0201300537 e 31671854 a J.V. e L.L., concedere il numero 31470435 a G.Y.) e il piano di talenti stranieri 100 (concessione numero JSB2014012 di J.V.).
Materials
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
Referenzen
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