Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade
Summary
O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.
Abstract
Globais defeitos na transcrição do RNA polimerase II podem ser ignorados pelos estudos de transcriptomic, analisando o estado estacionário do RNA. Com efeito, a diminuição global da síntese de mRNA foi mostrada para ser compensado por uma diminuição simultânea na degradação do mRNA para restaurar os níveis normais de estado estacionário. Portanto, a quantificação de todo o genoma de síntese de mRNA, independentemente do decaimento do mRNA, é o melhor reflexo direto da atividade transcricional de RNA polimerase II. Aqui, vamos discutir um método usando não-distorçer metabólica rotulagem de RNAs nascentes em Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Especificamente, as células são cultivadas por 6 min com uma uracila analógico, 4-thiouracil, e os rotulado RNAs recém transcritos são purificados e quantificados para determinar as taxas de síntese de mRNA individuais todos os. Além disso, usando rotulado Schizosaccharomyces pombe células como padrão interno permite comparar a síntese de mRNA em S. cerevisiae de diferentes linhagens. Usando este protocolo e encaixe os dados com um modelo cinético dinâmico, as taxas de decaimento do mRNA correspondente podem ser determinadas.
Introduction
As células respondem a sinais endógenos e exógenos, através da alteração dinâmica do seu programa de expressão do gene. Nos últimos anos, um enorme desenvolvimento das metodologias de todo o genoma permite a descrição precisa e abrangente de transcriptoma mudanças em condições diferentes. Na maioria dos estudos transcriptomic, sequenciamento de hibridação ou elevado-throughput de microarray são usadas para quantificar os níveis de RNA de uma fração de RNA total estado estacionário. Transcriptional mudanças sob uma perturbação específica podem exibir uma ampla gama de resultados possíveis, com um amplo espectro de genes sendo – up ou ativador ou mudanças de expressão de genes específicos. Expressão do gene é o resultado de um equilíbrio de aperfeiçoá-lo — ou estado estacionário — entre a síntese de RNA pela ARN-polimerase e outros processos que afetam os níveis de RNA. Transcrição de RNA polimerase II, incluindo suas três fases distintas (iniciação, alongamento e término), é altamente e intricadamente associado com processamento, exportação citoplasmática, tradução e degradação do mRNA.
Vários estudos recentes demonstraram que a decadência e a síntese de mRNAs são mecanismos acoplados e mostraram que efeitos transcriptional sobre mutação ou sob estímulos podem ser negligenciados quando quantificar o RNA total de estado estacionário. Em primeiro lugar, a detecção de alterações transcricionais através da análise dos níveis de estado estacionário de mRNA sempre depende de mRNAs Half-Life. Uma vez que a perturbação é introduzida, os níveis de estado estacionário de mRNAs com meia-vida longa serão muito menos afetados do que aqueles dos mRNAs com meia-vida curta. Portanto, a capacidade de detecção das alterações na síntese do RNA é fortemente tendencioso em favor de transcrições de curta duração, enquanto a análise das espécies de mRNA caudais pode falhar para revelar alterações dinâmicas na taxa de transcrição. Em segundo lugar, vários relatos têm demonstrado que, tanto em leveduras e mamíferos, mudanças globais na transcrição podem ser negligenciadas ao analisar os níveis de estado estacionário de mRNA. Isto é provavelmente devido os mecanismos que vinculam a síntese de mRNA e degradação, resultando em buffer de mRNA. Isto levou ao desenvolvimento de novos protocolos para quantificar a síntese de mRNA desacoplada da degradação, através da análise do mRNA recentemente transcrito. Nos últimos anos, foram apresentadas várias alternativas, incluindo sequenciamento pperigoso global (GRO-seq)1e transcrição de alongamento nativo sequenciamento (NET-seq)2,3. Aqui, apresentamos um protocolo desenvolvido inicialmente em células de mamíferos4,5,6 e em seguida adaptado para levedura7,8,9,10, 11, que é baseado no RNA etiquetando com um nucleosídeo thiolated ou base analógica, 4-thiouridine (4sU) ou 4-thiouracil (4tU), respectivamente.
Esse método especificamente purifica recém transcrito de RNA das células no qual ARN são pulso-etiquetadas com 4sU com virtualmente nenhuma interferência na homeostase da célula. Portanto, uma vez que as células são expostas a 4sU, a molécula rapidamente é captação, fosforilada para 4sU-trifosfato e incorporada em RNAs sendo transcritos. Uma vez rotulado de pulso, é possível extrair o RNA celular total (correspondente aos níveis de estado estacionário do RNA), e, posteriormente, a fração de RNA 4sU-rotulado thiol-especificamente modificado, levando à formação de uma ligação dissulfureto entre biotina e a recentemente transcrito de RNA4,5. No entanto, 4sU só pode ser a captação pelas células expressando um transporte de nucleosídeo, como o transporte de nucleosídeo equilibrative humano (hENT1), impedindo a sua utilização imediata em leveduras brotamento ou fissão. Enquanto um pode expressar a hENT1 em S. pombe ou S. cerevisiae, uma abordagem mais fácil pode ser alcançada usando o 4tU base modificado, uma vez que as células de levedura podem demorar até 4tU, sem a necessidade de expressão de um transporte de nucleosídeos10, 11 , 12 , 13. na verdade, o metabolismo do 4tU exige a atividade da enzima uracila Fosforibosiltransferase (UPRT). Em vários organismos, incluindo o fermento mas não mamíferos, UPRT é essencial para uma via de salvamento de pirimidina, reciclagem uracil para monofosfato de uridina.
Um viés importante em estudos de transcriptomic pode ser introduzido pela normalização entre diferentes amostras analisadas em paralelo. De fato, muitos fatores diferentes podem afetar a análise comparativa da transcriptoma do mutante e as estirpes de tipo selvagem: a eficiência do lysis da pilha, as diferenças na extração e recuperação de RNA e desvios na calibração de scanner para análise de microarray , entre outros. Como discutido acima, essas variações podem ser particularmente enganosas, quando são esperados efeitos globais na transcrição do RNA polimerase II. Uma elegante significa precisão comparar taxas de síntese de mRNA entre diferentes amostras foi projetada usando o fermento de fissão distantemente relacionados Schizosaccharomyces pombe como padrão interno. Por isso, um número fixo de rotulado S. pombe células é adicionado para as amostras de S. cerevisiae , células selvagem-tipo ou mutantes, antes da lise celular e de extração de RNA10. Posteriormente, RNAs de estado estacionário e recentemente sintetizadas de S. pombe e S. cerevisiae são quantificados por RT-qPCR ou através do uso de chips de microarray ou arranjar em sequência do elevado-throughput10. Combinando estes dados com modelagem cinética, absolutas taxas de síntese de mRNA e decadência em leveduras brotamento podem ser medidas.
No âmbito do presente manuscrito, vamos mostrar como a análise do RNA transcrito recentemente autorizados a revelar um papel global para os complexos coactivator SAGA e TFIID na transcrição de RNA polimerase II em brotamento fermento14,15, 16. Importante, após estudos quantificar os níveis de RNAm de estado estacionário em S. cerevisiae e sugeriram que a SAGA desempenha uma função predominante em um conjunto limitado de genes de fermento que são fortemente afetadas por mutações na SAGA, mas relativamente resistente à TFIID mutações17,18,19. Surpreendentemente, as atividades enzimáticas SAGA foram mostradas para agir sobre o genoma inteiro transcrito, sugerindo um papel mais amplo para esse ativador co na transcrição do RNA polimerase II. Observou-se diminuição da recrutamento de II de polimerase de RNA em genes mais expressos mediante a inativação da SAGA ou TFIID, sugerindo que estes coactivators trabalham juntos na maioria dos genes. Portanto, a quantificação de mRNA recentemente transcrito revelou que a SAGA e TFIID são necessários para a transcrição dos genes quase todos pela RNA polimerase II14,15,16. A implementação de mecanismos compensatórios emerge como uma maneira para que as células lidar com uma diminuição global da síntese de mRNA que é armazenado em buffer por uma simultânea redução global na degradação do mRNA. SAGA adiciona à lista de fatores, tendo um efeito global na transcrição do RNA polimerase II, a tais como subunidades de RNA Pol II10, o mediador coactivator complexo20, o general transcrição fator TFIIH21,22 e indirectamente, de elementos de degradação do mRNA máquinas9,10,23. Tais eventos compensatórios foram observados universalmente em mutantes SAGA, contabilidade para as modestas e limitadas alterações nos níveis de RNAm de estado estacionário apesar de uma diminuição global e grave na síntese de mRNA14. Análises semelhantes também foram realizadas em uma cepa de exclusão BRE1 , resultando em uma perda completa da ubiquitination histona H2B. Curiosamente, um tanto mais suave mas consistente efeito global na transcrição do RNA polimerase II poderia ser detectado na ausência de Bre1, indicando que a rotulagem metabólica do RNA recém transcrito no fermento pode detectar e quantificar uma vasta gama de mudanças no mRNA taxas de síntese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto ainda estão a melhorar todo o genoma de ferramentas para analisar as alterações na transcrição, a análise exclusiva da transcriptoma através da quantificação dos níveis de estado estacionário de RNA pode não refletir com precisão as alterações na atividade do RNA polymerase II. Com efeito, os níveis do mRNA são regulados não só pela síntese do RNA, mas também pela sua maturação e degradação. Para medir a síntese de mRNA desacoplada da degradação do mRNA, protocolos distintos foram des…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Laszlo Tora pelo seu apoio e V. Fisher, K. Schumacher e F. El Saafin para suas discussões. Tuberculose foi apoiado por uma bolsa Marie Curie-ITN (documento PITN-GA-2013-606806, NR-NET) e o arco de Fondation. Este trabalho foi financiado por fundos da Agence Nationale de la Recherche (SAGA2 ANR-15-CE11-0022). Este estudo foi suportado também por ANR-10-LABX-0030-INRT, um fundo de Estado francês, gerido pela Agence Nationale de la Recherche sob o quadro programa Investissements d’Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
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