Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse
Summary
Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.
Abstract
O neocórtex dos mamíferos é composto de muitos tipos de neurônios excitatórios e inibitórios, cada um com propriedades específicas eletrofisiológicas e bioquímicas, conexões sinápticas, e na vivo de funções, mas sua basic funcional e anatômica organização de celular para escala de rede é mal compreendida. Aqui nós descrevemos um método para a imagem tridimensional de neurônios fluorescente-etiquetadas em grandes áreas do cérebro para a investigação da organização celular cortical. Tipos específicos de neurônios são rotulados por injeção de traçadores neuronais retrógrados fluorescentes ou expressão de proteínas fluorescentes em ratos transgénicos. Amostras de cérebro de bloco, por exemplo, um hemisfério, são preparadas após a fixação, transparentes com tecido métodos de compensação e submetidas a fluorescente immunolabeling os tipos de células específicas. Grandes áreas são verificadas usando microscópios confocal ou dois fotões equipados com grandes objectivos de distância de trabalho e estágios motorizados. Esse método pode resolver a organização periódica dos módulos funcionais específicas do tipo microcolumn célula no neocórtex do mouse. O procedimento pode ser útil para o estudo da arquitetura celular tridimensional nas áreas diversas do cérebro e outros tecidos complexos.
Introduction
O neocórtex dos mamíferos é composto por um grande número de tipos de células, cada uma com os padrões de expressão de genes específicos, propriedades bioquímicas e eletrofisiológicas, conexões sinápticas, e na vivo funções1,2 ,3,4,5,6,7. Se estes tipos de células são organizados em estruturas repetidas tem sido pouco claras. Colunas corticais, incluindo colunas de orientação visual e somatossensorial barris, repetiram-se estruturas, mas sua organização celular permanece incerto8,9. Estas estão presentes nas áreas corticais específicas e não são um sistema de todo o cérebro.
Na camada neocortical 5, a grande maioria dos neurônios é classificada em quatro tipos principais. Um tipo importante de neurônios excitatórios, neurônios de projeção sub cerebral, projeta axônios para alvos subcorticais, incluindo o pons, medula espinhal e colículo superior e, portanto, representa a principal saída cortical via10. Neurônios de projeção cortical, um outro tipo importante de neurônios excitatórios, inervam o córtex10. Os neurônios inibitórios também contém duas classes principais: células parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando11.
Análises recentes indicam que os tipos de quatro célula são organizados em estruturas repetidas12,13,14. Tanto os neurônios de projeção cerebral secundário a12,13,14 e de neurônios de projeção cortical14 organizam em célula-tipo específico microcolumns com um diâmetro de 1 – 2 células. Células Parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando alinham especificamente com microcolumns de neurônios de projeção sub cerebral, mas não com microcolumns de neurônios de projeção cortical14. Microcolumns se alinhar periodicamente para formar um hexagonal lattice de matriz14 e estão presentes em múltiplas áreas corticais incluindo áreas visuais, somatossensorial e motor em cérebro de rato,12,14 e na língua áreas do cérebro humano13. Neurônios no microcolumn individual apresentam atividade sincronizada e ter respostas sensoriais semelhantes14. Estas observações indicam que tipos de células da camada 5 organizam em uma estrutura de treliça de microcolumn que representa a primeira organização de todo o cérebro conhecida de repetir módulos funcionais.
Microcolumns ter um raio de aproximadamente 10 µm e têm uma periodicidade espacial de aproximadamente 40 µm. Além disso, a orientação do microcolumns é paralela às suas dendrites apicais e alterações dependendo de sua posição no córtex14. Portanto, o sistema microcolumn é difícil de analisar usando fatias corticais convencionais com uma espessura típica de algumas dezenas de micrômetros. Além disso, a análise de periodicidade requer dados tridimensionais de uma vasta gama de áreas do cérebro e, portanto, a área de imagem típica de microscopia confocal ou na vivo imagem 2-fóton é muito estreita.
Recentemente, técnicas têm sido desenvolvidas para limpar tecidos grossos15,16. Aqui descrevemos a aplicação desses métodos para obter imagens tridimensionais, em grande escala os tipos de células principais na camada neocortical do rato 5 que compõem o sistema de microcolumn. Neurônios de projeção subcerebral são rotulados pela rotulagem retrógrada ou a expressão da proteína fluorescente verde reforçada em Crym-egfp ratos transgénicos12e projeção cortical neurônios são rotulados por ambos o retrógrado rotulagem ou pela expressão tdTomato em Tlx3–cre/Ai9 ratos17. Parvalbumin-expressando e somatostatina-expressando células são rotuladas por imuno-histoquímica. O método de (anticorpo escala S) AbScale18 é usado para o anticorpo que mancha experimentos, enquanto o método de SeeDB (ver profunda do cérebro)19 é usado para outras experiências. Esses métodos de superassem as dificuldades acima referidas dos métodos convencionais de imagem e revelam a organização celular exata da camada 514.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos os procedimentos para obter imagens tridimensionais em grande escala da organização de tipo específico de célula a tipos de grandes células na camada neocortical do rato 5. Em comparação com a coloração da fatia convencional, o método é mais útil na determinação da organização tridimensional do neocórtex. O método permite a aquisição de imagens do mais amplo e as mais profundas regiões do cérebro em comparação com o típico na vivo microscopia 2-fóton ou microscopia confocal…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Atsushi Miyawaki e Hiroshi Hama seus conselhos sobre as experiências de elAbSca, Charles Yokoyama para edição do manuscrito, Eriko Ohshima e Miyuki Kishino para sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado por fundos de pesquisa de RIKEN T.H. e Grants-in-Aid para a investigação científica do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão para T.H. (áreas inovadoras “Neurocircuitos mesoscópica”; 22115004) e S.S. (25890023).
Materials
| Crym-egfp transgenic mice | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre transgenic mice | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX #7909 | |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-01 | 0.5 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-02 | 1.0 mm thickness |
| Silicone rubber sheet | AS ONE | 6-611-05 | 3.0 mm thickness |
| Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Cover glass | Matsunami | C022241 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | C22841 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | C22843 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate | Invitrogen | C22842 | |
| Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen | C34778 | |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 310 | Pons injection |
| Injector pump | KD Scientific | KDS 100 | Superior colliculus injection |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine injection 1% with epinephrine | |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Avitene microfibrillar hemostat | Davol Inc | 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Incubator | UVP | HB-1000 Hybridizer | |
| Glass pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Electrode puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Paraffin Liquid, light | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Saline | Otsuka | 1326 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 26126-54 | |
| Tungsten needle | Inter medical | Φ0.1 *L200 mm | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 mL plastic tube | Falcon | 352070 | |
| α-thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D(-) Fructose | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| Two-photon microscope | Nikon | A1RMP | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm | |
| Water-immersion long working distance objectives | Nikon | CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm | |
| Motorized stage | COMS | PT100C-50XY | |
| Filter | Semrock | FF01-492/SP-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Filter | Semrock | FF03-575/25-25 | |
| Filter | Semrock | FF01-629/56 | |
| Filter | Chroma | D605/55m | |
| 5 mL plastic tube | AS ONE | VIO-5B | |
| 2 mL plastic tube | Eppendorf | 0030120094 | |
| Urea | Nacalai tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D(-)-sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| γ-Cyclodextrin | Wako | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 g/mL) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Water-immersion long working distance objectives | Olympus | XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| Anti-Somatostatin | Peninsula Laboratories | T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 | |
Referenzen
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