L’Identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement Bioassay-guidé
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à isoler et de caractériser la structure, puissance olfactive et réaction de composés de phéromones putatifs de la lamproie marine.
Abstract
Fractionnement guidée par essai biologique est une approche itérative qui utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Cette méthode a entraîné la caractérisation réussie des signaux chimiques qui fonctionnent comme des phéromones dans un large éventail d’espèces animales. La lamproie marine se fient olfaction pour détecter les phéromones qui médient réponses comportementales et physiologiques. Nous utilisons cette connaissance de la biologie des poissons à proposer des fonctions de phéromones putatifs et pour guider l’isolement et l’identification des composantes de l’actif de phéromone. La chromatographie est utilisée pour extraire, se concentrer et de séparer les composés de l’eau conditionnée. Électro-olfactogramme (EOG) enregistrements sont effectuées pour déterminer quelles fractions provoquer des réponses olfactifs. Tests comportementaux labyrinthe deux choix sont ensuite utilisés pour déterminer si une des fractions odorantes sont également actif sur le plan comportemental et induire une préférence. Méthodes spectrométriques et spectroscopiques fournissent le poids moléculaire et l’information structurale pour aider à l’élucidation de la structure. L’activité biologique des composés purs se confirme avec EOG et tests comportements. Les réponses comportementales observées dans le labyrinthe en fin de compte doivent être validés qu’en milieu de terrain pour confirmer leur fonction dans un cadre de cours d’eau naturel. Ces essais biologiques jouent un rôle double pour 1) guider le processus de fractionnement et 2) confirmer et préciser la bioactivité des composants isolés. Ici, nous rapportons les résultats représentatifs d’une identification de phéromone de la lamproie marine qui illustrent l’utilité de l’approche guidée par bioessai fractionnement. L’identification des phéromones de la lamproie marine est particulièrement importante parce qu’une modulation de son système de communication de phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler la lamproie de mer envahissante dans les Grands Lacs laurentiens. Cette méthode peut être facilement adaptée pour caractériser la communication chimique dans un large éventail de taxons et de faire la lumière sur l’écologie chimique d’origine hydrique.
Introduction
Les phéromones sont des signaux chimiques spécifiques, libérés par les personnes qui les aident à localiser les sources de nourriture, détecter les prédateurs et médiation des interactions sociales de leurs congénères1. Communication de la phéromone chez les insectes a été bien étudiée2; Cependant, l’identification chimique et la fonction biologique des phéromones de vertébrés aquatiques n’ont pas été étudiées aussi largement. Connaissance de l’identité et la fonction des phéromones libéré peuvent être appliquées pour faciliter la récupération des espèces menacées,3,4 ou contrôle antiparasitaire espèces5,6. L’application de ces techniques nécessite l’isolement et la caractérisation des composants bioactifs de phéromone.
Identification de la phéromone est une branche de la chimie des produits naturels. Progrès dans la recherche de phéromone a été partiellement limité en raison de la nature des molécules phéromones eux-mêmes. Les phéromones sont souvent instables et publié en petites quantités, et seulement quelques techniques d’échantillonnage existent pour détecter des quantités infimes de volatiles7,8 ou des composés solubles dans l’eau9. Méthodes pour identifier les phéromones comprennent 1) un dépistage ciblé des composés connus, métabolomique) 2 et 3) guidée par bioessai fractionnement. Un dépistage ciblé des composés connus les tests disponibles dans le commerce des sous-produits métaboliques des processus physiologiques hypothétiquement fonctionnent comme des phéromones. Cette approche est limité parce que les chercheurs peuvent tester uniquement composés connus et disponibles. Toutefois, il a conduit à l’identification réussie des hormones sexuelles chez le poisson rouge qui fonctionnent comme phéromones10,11,12. La métabolomique est une deuxième approche d’identification de phéromone qui distingue les produits métaboliques potentiels de petites molécules dans un système biologique13. Une comparaison des profils métaboliques des deux groupes (c.-à-d., un actif contre un extrait inactif) permet l’identification d’un profil métabolique potentiel de qui le métabolite est épuré, la structure est élucidée et les bioactivité est confirmé14. Effets additifs ou synergiques des formulations complexes des mélanges spécifiques sont plus susceptibles d’être détectés avec la métabolomique, parce que les métabolites sont considérés ensemble plutôt que comme une série de fractions13. Pourtant, la mise en œuvre de la métabolomique repose sur la disponibilité des références synthétiques parce que les données qui en résulte ne facilitent pas l’élucidation des nouvelles structures.
Fractionnement guidée par essai biologique est une approche intégrée et itérative qui s’étend sur deux domaines : chimie et biologie. Cette approche utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Un extrait brut est fractionné par une propriété chimique(p. ex., taille moléculaire, polarité, etc.) et testé avec enregistrements électro-olfactogramme (EOG) et/ou dans un test biologique. Les composants bioactifs sont éliminés en répétant ces étapes de fractionnement et EOGs et/ou biologiques. Les structures des composés actifs purs ont été dégagés par les méthodes spectrométriques et spectroscopiques, qui assurent le poids moléculaire et l’information structurale pour produire un modèle de ce composé à être synthétisé. Guidée par bioessai fractionnement peut produire divers métabolites et potentiellement roman phéromones avec des squelettes chimiques uniques qui ne risquent pas d’être prédites par les voies de biosynthèse.
Nous décrivons ici le protocole de fractionnement guidée par essai biologique utilisé pour isoler et de caractériser la bioactivité de la lamproie de mer mâle sex pheromone composés. La lamproie marine (Petromyzon marinus) est un modèle idéal de vertébrés pour étudier la communication phéromonale parce que ces poissons s’appuient fortement sur la détection olfactive des signaux chimiques d’arbitrer leur histoire de vie anadrome composé de trois étapes distinctes : les larves, juvénile et adulte. Larve de la lamproie marine se terrent dans les sédiments des cours d’eau douce, subissent une métamorphose radicale et de transforme en juvéniles qui migrent d’un lac ou l’océan où ils parasitent les poissons de la grande hostie. Après avoir détaché du poisson hôte, les adultes migrent vers des ruisseaux frayères, guidé par les phéromones migrateurs publiés par flux résident larves15,16,17,18,19 . Les mâles matures montent sur les frayères, libérer une phéromone de sexe multi-composants pour attirer des compagnons, frayer par intermittence pendant environ une semaine et puis mourir15,20. L’identification des phéromones de la lamproie marine est importante parce qu’une modulation du système de communication phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler les lamproies marines envahissantes dans les Grands Lacs laurentiens21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poissons vivants dans un monde chimique de composés encore être identifiés. Guidée par bioessai fractionnement s’est avérée essentiel pour identifier et caractériser les molécules bioactives qui assurent la médiation de nombreuses interactions chimiques, tels que ceux observés en saumon masu31, éléphants d’Asie,32et la grande lamproie marine33, 34,35. Fractionnemen…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l’US Geological Survey Hammond Bay Station biologique pour l’utilisation de leurs installations de recherche et le personnel du U.S. Fish and Wildlife Service et Pêches et Océans Canada pour fournir de la lamproie marine. Cette recherche a été financée par des subventions de la Commission des pêcheries des grands lacs à Weiming Li et Ke Li.
Materials
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
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