Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography
Summary
De draad myograph techniek wordt gebruikt om vasculaire vlotte spier functies en de scherm nieuwe drugs te onderzoeken. Wij rapporteren een gedetailleerd protocol voor het meten van de isometrische contractility van de muis mesenterische slagader en voor het screenen van de nieuwe skeletspierrelaxantia van vasculaire glad spierweefsel.
Abstract
De techniek van de myograph draad wordt gebruikt ter beoordeling van de contractility van vasculaire gladde spieren in reactie op de depolarisatie, GPCR agonisten/remmers en drugs. Het wordt wijd gebruikt in vele studies op de fysiologische functies van vasculaire gladde spieren, de pathogenese van vasculaire ziekten zoals hypertensie, en de ontwikkeling van gladde spieren comfortabel drugs. De muis is een veelgebruikt model dier met een grote pool van ziekte modellen en genetisch gemodificeerde stammen. Introduceerden we deze methode voor het meten van de isometrische contractie van de mesenterische slagader muis in detail. Een 1.4-mm segment van muis mesenterische weerstand slagader was geïsoleerd en gemonteerd op een myograph kamer door twee stalen draden via haar lumen. Na evenwichtsinstelling en normalisatie stappen, was het schip segment Potentiation door een oplossing van de hoog-K+ tweemaal vóór de bepaling van de contractie. Als een voorbeeld van de toepassing van deze methode in Geneesmiddelenontwikkeling, we het comfortabel effect van een nieuwe natuurlijke stof, neoliensinine, geïsoleerde van een Chinees kruid, embryo’s van als het zaad van de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) gemeten op muis lymfklieren slagaders. De segmenten van de schip gemonteerd op de kamer van de myograph werden gestimuleerd met een high-K+ -oplossing. Wanneer de kracht spanning een stabiele duurzame fase bereikt, werden cumulatieve dosissen van neoliensinine toegevoegd aan de kamer. We vonden dat neoliensinine een dosis-afhankelijke comfortabel effect gehad op gladde spiercontractie, zo suggereert dat het draagt potentiële activiteit tegen hypertensie. Bovendien, zoals het schip segment kan ten minste 4 uur na montage overleven en onderhouden van contractility geïnduceerd door de high-K+ -oplossing voor vele malen, wij stellen voor dat kan de draad myograph systeem worden gebruikt voor het tijdrovende proces van drug screening.
Introduction
Het klein schip myograph systeem hier gebruikt was voor het meten van de isometrische contractie van kleine weerstand vaartuigen met een interne diameter variërend van 100 tot 400 µm. geïsoleerde kleine vaartuigen (ongeveer 2 mm lang) zijn ingevoegd door twee 40-µm diameter draden en waren toen gemonteerd op de micrometer-side en transducer-side kaken opeenvolgend. Deze techniek van de myograph was eerst voorgesteld in 19721 en vervolgens ontwikkeld voornamelijk door Mulvany en zijn collega’s2,3,4,5,6. Het is nu een volwassen techniek met stabiele uitrusting, gemakkelijk prestaties en een standaard normalisatie procedure7,8,9. We gebruikt deze methode met een aantal wijzigingen voor metingen in de mesenterische slagader van de muis.
Vasculaire glad spierweefsel lijnen de muren van bijna alle bloedvaten. Hun fundamentele functie is het genereren van krachten door contractie in reactie op verschillende stimuli. De normale contractility van vasculaire glad spierweefsel is essentieel voor de verordening van de bloeddruk en voeding aanvullen10. Abnormale regulering van bloeddruk resultaten in een verscheidenheid van ziekten zoals hypertensie, hartfalen en ischemie. Verschillende studies hebben gesuggereerd dat abnormale bloeddruk altijd gekoppeld aan disfunctionele vasculaire gladde spieren contractility7,11,12,13 is. De methode myograph kunt onderzoek van isometrische contractility van muis vaartuigen geïnduceerd door verschillende stimuli met inbegrip van vasoconstrictors, remmers en drugs. Succesvolle metingen van contractie zal helpen ons te begrijpen van de mechanismen voor onderhoud van de bloeddruk en de pathogenese van vasculaire glad spierweefsel-geassocieerde ziekten en verkennen van nieuwe therapeutische benaderingen.
Vele Chinese kruiden hebben op grote schaal gebruikt voor de klinische behandeling van vasculaire ziekten; hun effectieve ingrediënten blijven echter meestal onbekend. Isolatie en identificatie van de effectieve componenten is dus zeer belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnen. Multi draad myograph-technologie biedt een eenvoudige benadering voor het screenen van actieve bestanddelen in kruiden. We hebben verschillende studies met behulp van het systeem van de myograph klein schip te onderzoeken muis mesenterische slagader contractie gemeld en natuurlijke verbindingen geïdentificeerd met anti-hypertensie activiteit12,13,14. Hier beschrijven we de gedetailleerd protocol voor de myograph-methode en beoordelen het comfortabel effect van neoliensinine geïsoleerd van embryo’s van zaad van de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hypertensie is een wijdverspreide volksgezondheid uitdaging vanwege de ernstige complicaties, met inbegrip van cardiovasculaire en nier-ziekten16. Begrijpen van de pathogenese van hypertensie en verkennen meer anti-hypertensieve drugs is geworden een dringende taak op dit gebied. Bloeddruk wordt gegenereerd en onderhouden door de perifere weerstand van het verkeer. Volgens Poiseuille van de wet, de relatief kleine slagaders genereren een groot deel van de bloedsomloop weerstand en dienen als de do…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Wei Qi He (Soochow Universiteit, Suzhou, China) en Dr. Yan Ning Qiao (Shaanxi Normal University, Xi’an, China) voor de technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant 31272311, 81373295 en 81473420) en het Project gefinancierd door de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu instellingen voor hogeronderwijs (Grant nr. ysxk-2016).
Materials
| Multi wire myograph system | DMT | 610-M | |
| Stainless steel wire | DMT | 400447 | |
| Geuder dissection scissor | DMT | 400431 | |
| Dumont forceps | DMT | 300413 | |
| PowerLab/8SP | ADInstruments | ML785 | |
| Software | ADInstruments | LabChart 5 | |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886 | |
| KCl | SigmaAldrich | P5405 | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901 | |
| MgCl2·6H2O | SigmaAldrich | M2393 | |
| D-Glucose | SigmaAldrich | G6152 | |
| HEPES | Sangon Biotech | A100511-0250 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045 | |
| DMSO | SigmaAldrich | D2650 |
Referenzen
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents and Actions. 2 (5), 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile Properties of Small Arterial Resistance Vessels in Spontaneously Hypertensive and Normotensive Rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Nyborg, N. An increased calcium sensitivity of mesenteric resistance vessels in young and adult spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology. 71 (2), 585-596 (1980).
- Mulvany, M. J. . Procedures for investigation of small vessels using small vessel myograph. , (2004).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. The Journal of Physiology. 275, 88-101 (1978).
- Michael, S. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (18), 6702-6707 (2008).
- Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- del Campo, L., Ferrer, M. . Wire Myography to Study Vascular Tone and Vascular Structure of Isolated Mouse Arteries. , (2015).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiological Genomics. 42 (3), 169-187 (2010).
- Crowley, S. D., et al. Distinct roles for the kidney and systemic tissues in blood pressure regulation by the renin-angiotensin system. The Journal of Clinical Investigation. 115 (4), 1092-1099 (2005).
- Qiao, Y. N., et al. Myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1) regulates the contraction and relaxation of vascular smooth muscle and maintains blood pressure. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22512-22523 (2014).
- He, W. Q., et al. Role of myosin light chain kinase in regulation of basal blood pressure and maintenance of salt-induced hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), H584-H591 (2011).
- Yang, G. M., et al. Isolation and identification of a tribenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera Gaertn, a novel potential smooth muscle relaxant. Fitoterapia. 124, 58-65 (2018).
- Slezák, P., Waczulíková, I., Bališ, P., Púzserová, A. Accurate Normalization Factor for Wire Myography of Rat Femoral Artery. Physiological Research. 59 (6), 1033-1036 (2010).
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. The Lancet. 365 (9455), 217-223 (2005).
- Good, N. E., et al. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Biochemie. 5 (2), 467-477 (1966).
