توصيف لتمزق الأغشية البلازمية ملكل بوساطة في نيكروبتوسيس
Summary
نحن التقرير أساليب لتوصيف لتمزق الأغشية البلازمية ملكل بوساطة في نيكروبتوسيس بما في ذلك التصوير المجهري خلية العيش التقليدية و [كنفوكل]، وفحص المجهر الإلكتروني، وربط دهني المستندة إلى الرنين المغناطيسي النووي.
Abstract
نيكروبتوسيس هو طريقا موت خلية مبرمجة سببها تفعيل مستقبلات التفاعل كيناز البروتين 3 (RIPK3)، التي فوسفوريلاتيس وينشط بسيودوكيناسي كيناز مثل مجال مختلط النسب، ملكل، تمزق أو بيرميبيليزي غشاء البلازما . نيكروبتوسيس طريقا التهابات المرتبطة بأمراض متعددة بما في ذلك المناعة الذاتية، الأمراض المعدية والقلب والأوعية الدموية، والسكتة الدماغية، ونيوروديجينيريشن، والسرطان. وهنا يصف لنا البروتوكولات التي يمكن استخدامها لوصف ملكل كالجلاد تمزق الأغشية البلازمية في نيكروبتوسيس. يمكننا تصور عملية نيكروبتوسيس في الخلايا باستخدام التصوير خلية يعيش مع الفحص المجهري الفلورية التقليدية و [كنفوكل]، وفي الخلايا الثابتة باستخدام المجهر الإلكتروني، التي كشفت معا إعادة توزيع ملكل من سيتوسول للبلازما غشاء قبل الاستقراء ثقوب كبيرة في غشاء البلازما. ونقدم في المختبر تحليل الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) باستخدام الدهون لتحديد المغيرون المفترضة لوساطة ملكل نيكروبتوسيس. استناداً إلى هذا الأسلوب، حددنا كمية الدهن-ربط اﻷفضليات والفوسفات الفوسفاتيديل-اينوزيتول (نقطة) موثقات الحرجة من ملكل المطلوبة لاستهداف غشاء البلازما وبيرميبيليزيشن في نيكروبتوسيس.
Introduction
ويسرت تحديد العناصر الوراثية في نيكروبتوسيس استخدام نماذج حيوانية لاختبار الأثر المترتب على نيكروبتوسيس في علم وظائف الأعضاء والأمراض1،2،3،،من45. خروج المغلوب من RIPK3 أو ملكل في الفئران أثر ضئيل في التوازن الإنمائي والكبار مما يوحي بأن نيكروبتوسيس ليست ضرورية للحياة3،6. وعلاوة على ذلك، لا تحتوي على أنواع معينة من الجينات أما RIPK3 أو ملكل، ودعم الدور غير الضرورية نيكروبتوسيس في الحيوانات7،8. من ناحية أخرى، كشفت تتحدى نماذج حيوانية خروج المغلوب مع مختلف الأمراض التي يسببها في المختبر دوراً هاما في نيكروبتوسيس في التهاب والحصانة الفطرية، والعدوى الفيروسية9،10، 11 , 12.
يمكن تنشيط نيكروبتوسيس بعدة طرق بإشارات من خلال أجهزة الاستشعار المختلفة الحصانة الفطرية، كافة التي تؤدي إلى تفعيل RIPK31،،من1314. RIPK3 النشطة بدوره فوسفوريلاتيس وينشط ملكل3،4،5،،من67،،من89،10 ،11،،من1213،14،15،16،،من1718. درس أكثر من غيرها، وربما ينطوي بالطريقة الأكثر تعقيداً، مما يؤدي إلى تنشيط RIPK3 الموت مستقبلات ربط، الذي إلى على أساس التكوين المصب من المجمعات إرسال الإشارات لحمل أما المبرمج أو نيكروبتوسيس1. نيكروبتوسيس تستتبعه عندما إشارات من خلال RIPK1 هو يفضل ويؤدي إلى إشراك RIPK319،20. هو يفضل هذه النتيجة بسهولة على تثبيط الدوائية أو حذف الوراثية caspase 8، مثبط ذاتية المفترضة من نيكروبتوسيس التي تحافظ نيكروبتوسيس في خليج. تربط بين RIPK1 وينشط RIPK3. طريقة أخرى لتنشيط نيكروبتوسيس من خلال عدد القتلى مثل مستقبلات الإشارات TLR3/TLR4، الذي يشارك وينشط RIPK3 عن طريق يحتوي على مجال النقل الدولي البري الذي يحفز محول الانترفيرون-بيتا (تريف)21. بعد طريقة أخرى ليموت قبل نيكروبتوسيس بتفعيل استشعار الحمض النووي داي، الذي يشرك مباشرة وينشط RIPK322.
ملكل بروتين سيتوسوليك تتألف من مجال حزمة (ملحوظة) اللولب الطرفي ن وفي مجال بسيودوكيناسي ج-طرفية (بسكد) مرتبطة ب منطقة تنظيمية قوس3. في الخلايا الطبيعية، تم العثور على ملكل في سيتوسول حيث أنه يعتقد أن يكون في مجمع غير نشطة مع RIPK314. تفعيل نيكروبتوسيس مشغلات الفسفرة RIPK3 من ملكل في حلقة التنشيط بسكد، ومواقع إضافية محتملة في ملحوظة وقوس15،3،23. الفسفرة الحث على تغيير كونفورماشونال في ملكل التي ينتج عنها تفكك من RIPK314. الإصدار تغييرات conformational غير مفهومة في القوس من بسكد24. يتوسط القوس، الذي يحتوي على لوالب 2، أوليجوميريزيشن ملكل في تريمير المفترضة من خلال اللولب ج-مبنى رقم25. يمنع اللولب الطرفي ن من القوس المجال NB، هو أمر أساسي لغشاء بيرميبيليزيشن24،26. بمعزل عن غيرها، المجال NB كافية لحمل permeabilization غشاء البلازما ونيكروبتوسيس16،،من2427. أعيد نشاط برو-نيكروبتوتيك ملحوظة في الماوس الخلايا الليفية الجنينية قاصرة في ملكل (ملكل-/- ميفس). ملحوظة: هو مجال ملزم دهن ضلعت تفضيلي diphosphate فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5 فسفوليبيد (المرحلة2). واقترحنا إليه التدرجي لتفعيل ملكل، حيث يسهل أوليجوميريزيشن قوس تجنيد ملكل لغشاء البلازما عن طريق التفاعلات الضعيفة من ملحوظة مع الأقطاب رئيس الفريق2 النقطة24. في الغشاء، يخضع NB التعرض ينظم موقع إضافية عالية تقارب ملزمة للنقطة2، الذي هو يخفيها في القوس في ملكل غير نشط. إجمالاً، زعزعة تفاعلات متعددة ملحوظة مع النقطة2 غشاء البلازما مما يؤدي إلى تمزق به، على الرغم من أن لا يكون تم توضيح الآلية الجزيئية لهذه الأحداث.
نحن هنا لتوضيح الأساليب المحددة المستخدمة لتوصيف وظيفة ملكل كالجلاد نيكروبتوسيس24. على وجه الخصوص، نحن نركز على المجال الأدنى ملكل، وملحوظة وقوس (NBB)، الذي يخضع لتثبيط قوس ويمكن تفعيلها من خلال ثنائي القسري للحث على تمزق الأغشية البلازمية ونيكروبتوسيس. يصف لنا نظامنا التعبير إيندوسيبلي جنبا إلى جنب مع المخدرات التي يسببها فكبب بوساطة ثنائي القسري لتصوير خلية يعيش، والمجهر الإلكتروني للخلايا التي تمر نيكروبتوسيس. بالإضافة إلى ذلك، توضح لنا تحليلنا في المختبر الرنين المغناطيسي لتفاعلات NBB مع فوسفاتيديلينوسيتولس (نقطة).
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن توفير بروتوكولات للتقنيات التي نحن جنبا إلى جنب لتورط ملكل هو الجلاد المفترضة ل تمزق الأغشية البلازمية24. بالإضافة إلى فك رموز الشبكة التنظيمية التي تنظم بوساطة ملكل نيكروبتوسيس، يمكن استخدام هذه التقنيات بشكل مستقل لتوصيف النظم البيولوجية المناسبة الأخرى. من الناحية ال…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لا شيء.
Materials
| Cloning and cell line generation | |||
| pRetroX-TRE3G | Clontech | 631188 | |
| Tet-On transactivator plasmid | Llambi et al., 2016 | ||
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) mlkl-/- | Dillon et al., 2014 | ||
| Blasticidin S Hydrochloride | Thermo Fisher Scientific | BP2647100 CAS#3513-03-9 | |
| Cell death quantification and live-cell microscopy | |||
| Doxycycline | Clontech | 631311 CAS# 24390-14-5 | |
| B/B Homodimerizer AP20187 | Takara | 635059 CAS# 195514-80-8 | |
| SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Syto16 | Thermo Fisher Scientific | S7578 | |
| NMR | |||
| 15N Ammonium Chloride | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467-10 CAS# 12125-02-9 | |
| Deuterated DTT | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2622-1 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385-1 CAS# 7789-20-0 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 CAS# 69227-93-6 | |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (Brain, Porcine) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 840046X CAS# 383907-42-4 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt) (18:0 PI) | Avanti Polar Lipids | 850143 CAS# 849412-67-5 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (ammonium salt) (18:1) | Avanti Polar Lipids | 850149 CAS# 799268-53-4 | |
| Specialized Equipment | |||
| IncuCyte FLR or ZOOM | Essen BioScience, Inc. | Live-cell microscopy imaging | |
| Helios NanoLab 660 DualBeam | Thermo Fisher Scientific | Electron microscope | |
| Software | |||
| IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR) | Essen BioScience, Inc. | http://www.essenbioscience.com | Imaging analysis |
| FEI MAPS | Thermo Fisher Scientific | https://www.fei.com/software/maps/ | EM analysis |
| TopSpin v3.2 | Bruker BioSpin | http://www.bruker.com | NMR data collection |
| CARA v1.9.1.7 | http://cara.nmr.ch/ | NMR data analysis | |
| Slidebook | 3i (Intelligent Imaging Innovations) | https://www.intelligent-imaging.com/slidebook | Confocal microscopy |
Referenzen
- Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
- Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
- Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
- Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
- Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
- Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
- Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
- Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
- Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
- Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
- Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
- Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
- Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
- Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
- Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
- Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
- Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
- Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
- Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
- Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
- Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
- Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
- Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586 (2011).
- Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
- Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
- Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
- Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).
