感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析
Summary
このプロトコルの目標より大きな規模での NMDA 受容器 (NMDAR) の研究と、低分子化合物の変調作用の検討と治療への応用です。
Abstract
N メチル D アスパラギン酸 (NMDA) 受容体 (NMDAR) はグルタミン酸に分類され、学習と記憶に重要な役割を持っています。表現としてどちらかに- または下-activity の突然変異、発現、人身売買、またはローカリゼーションによる NMDAR の故障は、中枢神経系を中心に、多数の病気に貢献できます。したがって、化合物と低分子化合物の探索を促進することと同様、受容体の生物学を理解することは、神経疾患と闘うための継続的な努力で重要です。現在の受容体の勉強方法低スループット、高コスト NMDAR 仲介された毒性を防ぐためにチャネル遮断薬の必要な存在のためにその機能能力を研究することができないなどの制限があります。また、既存のアッセイ系のみグルタミン酸による刺激に敏感である、グリシン、NMDAR の他の共同のリガンドによる刺激に対する感受性を欠いています。両方共配位子、グルタミン酸や D セリン ・ グリシンへの感受性と NMDA 受容体を研究する高スループット力と最初のプレート ベースのアッセイを紹介します。このアプローチ様々 な NMDAR サブユニット組成の研究でき、受容体の機能解析グリシンやグルタミン酸に敏感なモードで。また、メソッドでは、測定中の阻害剤の存在は必要がないです。正と負のアロステリック変調器の効果は、このアッセイで検出できるし、NMDAR の既知の薬理学は、私たちのシステムにレプリケートされています。この手法は既存の方法の限界を克服、経済的であります。この手法は NMDAR を介した病態の治療の発見を加速すると考えています。
Introduction
医学の現在の進歩、平均寿命が大幅に増加します。しかし、加齢に伴う疾患の有病率がのであります。中枢神経系 (CNS)、他の中で、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 統合失調症などの疾患は例外ではありません、次の十年1,で増加する予測されています。2,3N メチル D アスパラギン酸塩の受容器 (NMDAR) として知られているイオン型グルタミン酸受容体の機能不全は、アルツハイマー病、統合失調症、外傷性脳損傷、脳卒中、糖尿病、緑内障等保証のにリンクされている、。効果的な疾患修飾療法4,5,6、7の開発のための生物を勉強する必要があります。
NMDARs は、4 つのモノマーまたはサブユニット4,8,9で構成されます。NMDAR の構造は、脳7,10内の発達と地域の変動を示しています。NMDARs は、シナプス可塑性と認知及び呼吸と歩行11,12,13のリズムの生成に関与しています。電位依存性チャネルとしてそれは、安静時の膜電位伝導非主 (-70 mV) し、さらにイオンの透過を防ぐためにマグネシウムによってブロックします。2 配位子、グルタミン酸およびグリシン/D-セリン、バインドによってチャネルがアクティブになるし、シナプス膜に同時脱分極は AMPA 受容体、イオン型グルタミン酸受容体の別のサブクラスによって仲介されます。分極防止作用は、特にカルシウム14,,1516陽イオンの流入を有効にする、NMDAR のマグネシウム閉塞を削除します。にもかかわらず NMDAR の活性化は細胞の生存に不可欠な過剰な活性化は細胞死17,18,19応需型につながります。これは、受容体の複雑な性質に加えて難しく研究を実施する効果的な治療法を開発するために必要です。
別の方法は、NMDAR の研究に開発されています。ただし、それぞれの注意事項が付属しています。たとえば、1 つの広く使われている技術は安定したセルライン テトラサイクリン誘導性プロモーター (テトの)20の制御の下での細胞内カルシウム NMDAR 依存性の変化を測定する蛍光ベースの試金であります。ただし、このシステムに必要な配位子の激濃度と NMDAR の阻害剤が測定中に存在している要件不可能になります競争力の拮抗筋の活動を検出します。他の同様のシステムは、機能的受容体の発現は、ケタミン21,22細胞培養を維持するなどの拮抗を必要とする毒性を引き起こします。これらのチャネルのブロッカーは、受容体のコアに座るし、受容体の機能解析と干渉すること特にプレート ベースの形式で、洗いにくい。最後に、パッチなどの電気生理学的計測、スループットの制限があるし、大規模な研究は、非常に高価な23。にもかかわらず、上記のシステムはグリシンの刺激に敏感したがって、課題となる、NMDAR のグリシン依存性活性を勉強します。
ここでは、議論の制限を克服 NMDAR の勉強への新しいアプローチについて述べる。バキュロ ウイルス発現系としてはほとんど 16 時間で受容体のサブユニットの最適比の機能レベルを表現する技術を使用します。さらに、バキュロ ウイルスの使用によりシンプルかつコンビナトリアル アプローチは、異なる組換え NMDAR のサブタイプの広範な評価を提供します。他のアッセイとは異なり、このプロトコルには弱いアンタゴニストの使用のためチャネル遮断薬は必要ありません。メソッドの最も強い利点は弱い拮抗薬の後のウォッシュ アウトはグリシン/D-セリン、グルタミン酸の両方のデュアルの変調に加えて個々 グリシンとグルタミン酸結合部位の変調に敏感で受容体リガンド結合サイト。試金は NMDAR 受容体の既知の薬理学とその既知の正と負の変調器の効果を繰り返します。最後に、この生体外細胞アッセイの生成過剰なカルシウムの流入によって引き起こされる細胞毒性を克服でき、NMDAR の変調器の発見を加速することができます高スループット方法で受容体の機能解析病にある州。
Protocol
Representative Results
Discussion
この試金の成功は、使用される HEK 細胞の状態によって大きく異なります。細胞の急激な増加を受けて、低通過数を使用する必要があります。このアッセイ多く転送と警告を使用して、ソリューションの追加はその結果で高い精度を確保します。化合物およびその他のすべての試薬の濃度は、エラーを最小限に抑えるためにクロス チェックもする必要があります。アッセイバッファー カルシ…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、郵便局バカロレア学者プログラムそしてノバルティス バイオメディカル研究本研究を資金調達のための全体として感謝したいと思います。
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
Referenzen
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