Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas
Summary
Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.
Abstract
Regulamento de compactação da cromatina é um processo importante que regula a expressão gênica em eucariontes superiores. Embora a compactação da cromatina e regulação da expressão gênica são comumente interrompidos em muitas doenças, tem faltado um locus específico, endógeno e reversível método para estudar e controlar esses mecanismos de ação. Para resolver este problema, desenvolvemos e caracteriza-se novas moléculas bifuncionais gene-regulação. Um componente da molécula bifuncional vincula uma âncora de ADN-proteína assim será recrutado para um locus alelo-específico. O outro componente envolve endógena cromatina-modificando maquinaria celular, recrutamento destas proteínas para um gene de interesse. Estas pequenas moléculas, chamadas químicas epigenéticas modificadores (CEMs), são capazes de controlar a expressão do gene e o ambiente de cromatina de forma dose-dependente e reversível. Aqui, detalhamos uma abordagem CEM e sua aplicação para diminuir a expressão dos genes e acetilação de cauda em um repórter de proteína fluorescente verde (GFP) localizado no locus de Oct4 em células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Podemos caracterizar o chumbo CEM (CEM23) usando microscopia fluorescente, citometria de fluxo e imunoprecipitação da cromatina (ChIP), seguido de uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Enquanto o poder deste sistema é demonstrado no locus a Oct4 , conceitualmente, a tecnologia CEM é modular e pode ser aplicada em outros tipos de células e em outros loci genômicos.
Introduction
Cromatina consiste de DNA enrolado ao redor de proteínas octamer de histona que formam a partícula nucleosome do núcleo. Regulamento de compactação da cromatina é um mecanismo essencial para a adequada DNA expressão, replicação e reparo1,2,3. Uma maneira em que as células controlam o nível de compactação é através da adição ou remoção de várias modificações de cauda de histona borne-translational. Dois tais modificações incluem acetilação de lisina (1), que é mais comumente associada com a ativação do gene, e metilação de lisina (2), que pode ser associada com ativação do gene ou repressão, dependendo do contexto de aminoácido. A adição das marcas de acetilação e metilação é catalisada por histona acetiltransferases (chapéus) e histona metiltransferases (HMTs), respectivamente, Considerando que a remoção da marca é feita por histona deacetilases (HDACs) e demethylases de histona (HDMs ), respectivamente,4,5. Embora a existência destas proteínas tem sido conhecida há décadas, muitos mecanismos de máquinas como cromatina-modificando obras devidamente regular expressão do gene continuam a ser definido. Uma vez que processos regulatórios de cromatina são prejudicado em muitas doenças humanas, novos insights mecanicistas podem levar a futuras aplicações terapêuticas.
O cromatina na vivo ensaio (CiA) é uma técnica recentemente descrita que usa um indutor químico de proximidade (CIP) para controlar a cromatina-modificando o recrutamento de maquinaria para um locus específico6. Esta tecnologia tem sido costumava estudar uma lista em expansão da dinâmica de cromatina, incluindo proteínas histonas-modificando, empresas de reestruturação da cromatina e transcrição fatores6,7,8,9. CIP-baseado da cromatina tethering de proteínas expressas exogenamente também foi estendido passado CiA para modular loci genéticos não modificado pela utilização com uma proteína associada agrupados regularmente intercaladas curta palíndromo repete CRISPR desativada (dCas9) 10 , 11. no sistema da CiA, mESCs foram modificados para expressar um gene repórter GFP no locus de Oct4 , uma área estritamente regulamentado e altamente expressa do genoma mESC. Anteriormente, este sistema tem sido aplicado para descrever o recrutamento dose-dependente e reversível da proteína de heterocromatina exogenamente expressa 1 (HP1), uma enzima que vincula o H3K9me3 e propaga marcas repressivas (por exemplo, H3K9me3) e DNA metilação de6. Para realizar este tipo de estratégia de recrutamento, os mESCs estão infectados com um plasmídeo que expressa uma proteína de ligação FK506 (FKBP) ligada a um Gal4, que é uma âncora de ADN-proteína que se liga a uma matriz de ligação Gal4 montante do repórter GFP. As células são infectadas também com um domínio de ligação-FKBP-rapamicina (FRB) conectado ao HP1. Quando os mESCs são expostos a concentrações baixas nanomolar do PIC, rapamicina, ambos FRB e FKBP, estão reunidos no locus de alvo. Dentro de dias de tratamento de rapamicina, expressão do gene do alvo é reprimido, como evidenciado por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência e acetilação da histona é diminuída, mostrado pelo ChIP e sequenciamento de bissulfito. Enquanto o desenvolvimento e a validação desta abordagem foram significativos avanços no campo da pesquisa de cromatina e regulação, uma desvantagem é a necessária expressão exógena de cromatina-modificando máquinas.
Para tornar a tecnologia baseada no recrutamento de enzimas fisiologicamente relevantes apenas endógenas e fazer um sistema mais modular, projetamos e caracteriza-se novas moléculas bifuncionais, denominadas CEMs (Figura 1)12. Um componente das CEMs inclui FK506 que, semelhante a rapamicina, liga-se firmemente e especificamente para FKBP. Assim, os CEMs ainda serão recrutados para o locus de Oct4 em mESCs da CiA. O outro componente das CEMs é um agrupamento que vincula a maquinaria de cromatina-modificando endógena. Em um estudo piloto, testamos CEMs que contêm inibidores HDAC. Enquanto o conceito de usando um inibidor para recrutar HDACs parece contra-intuitivo, o inibidor, no entanto, é capaz de recrutar atividade HDAC para o gene de interesse. Isso é realizado por (1) redirecionando o HDAC para o locus, liberando a enzima e aumento da densidade das HDACs un-inibidas na área e inibição de HDAC (2) manutenção no locus, mas recrutar complexos repressivos que ligam para as HDACs inibidas, ou (3) uma combinação de ambos. No estudo anterior, mostramos que o CEMs foram capazes de reprimir com sucesso a repórter GFP de forma dose – e tempo-dependente, bem como de uma maneira que era rapidamente reversível (ou seja, dentro de 24 horas)12. Nós caracteriza a capacidade da tecnologia CEM apresentada aqui a expressão de gene de controle usando microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e a capacidade para controlar o ambiente de cromatina usando ChIP-qPCR6. Aqui, descrevemos um método para usar e caracterizando os CEMs, que facilitarão a adaptação deste sistema para responder perguntas adicionais relacionadas à biologia da cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos o recentemente desenvolvido sistema CEM sendo aplicado para regular a expressão de gene e ambiente de cromatina em um gene específico de forma dose-dependente. Nós fornecemos um método preciso para estudar a dinâmica envolvida na regulação da expressão gênica através do recrutamento seletivo das proteínas reguladoras específicas cromatina endógena. Esta é uma tecnologia altamente modular que pode ser aplicada para investigar como diferente proteínas e cromatina-modificação de complexos …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer aos membros dos laboratórios Hathaway e Jin para suas discussões úteis. Os autores também agradecer Dan Crona e Ian MacDonald por sua leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte por Grant R01GM118653 de os E.U. National Institutes of Health (para N.A.H.); e por subsídios R01GM122749, R01CA218600 e R01HD088626 de o E.U. National institutos de saúde (JJ). Este trabalho também foi apoiado por um nível 3 e um estudante concedem da UNC Eshelman Instituto de inovação (N.A.H e A.M.C, respectivamente). Financiamento adicional de um GM007092 de T-32 (a A.M.C) com suporte a este trabalho. Obteve-se dados de citometria de fluxo na UNC Flow Cytometry Core instalação financiado por um P30 CA016086 Cancer Center núcleo apoio Grant para o UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
Referenzen
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