用化学表观修饰因子重定向细胞机械抑制基因转录
Summary
对染色质环境的调节是正确基因表达所需的必要过程。在这里, 我们描述了一种方法来控制基因表达, 通过招募的染色质修改机制, 基因特异和可逆的方式。
Abstract
染色质压实调控是控制高真核生物基因表达的重要过程。虽然染色质压实和基因表达调控在许多疾病中普遍被打乱, 但缺乏一个轨迹特异、内生和可逆的方法来研究和控制这些作用机制。为解决这一问题, 我们开发了新的基因调控双分子的特点。双分子的一个成分结合 DNA 蛋白锚, 使其被招募到一个等位基因特定的轨迹。另一个成分参与内源性细胞染色质修饰机制, 将这些蛋白质招募到感兴趣的基因上。这些小分子, 称为化学后生修饰语 (CEMs), 能够以剂量依赖性和可逆的方式控制基因表达和染色质环境。在这里, 我们详细介绍了一个方法和它的应用, 以减少基因表达和组蛋白尾乙酰化在绿色荧光蛋白 (GFP) 记者位于Oct4的位置在小鼠胚胎干细胞 (mESCs)。我们用荧光显微镜、流式细胞术和染色质免疫沉淀 (芯片) 来描述 CEM23 的铅, 然后定量聚合酶链反应 (qPCR)。虽然这个系统的力量在Oct4轨迹上显示, 在概念上, 杰姆技术是模块化的, 可以应用于其他细胞类型和其他基因组的基因座。
Introduction
染色质由 DNA 包裹在组蛋白 octamer 蛋白组成的核心核粒子。规范染色质压实是正确的 DNA 修复, 复制和表达1,2,3的基本机制。细胞控制压实水平的一种方法是通过添加或移除不同的平移后组蛋白尾修饰。两个这样的修改包括 (1) 赖氨酸乙酰化, 这是最常见的与基因激活, (2) 赖氨酸甲基化, 这可以与基因激活或压迫, 取决于氨基酸上下文。添加乙酰化和甲基的标记由组蛋白乙酰转移酶 (帽子) 和组蛋白甲基转移酶 (HMTs) 分别催化, 而去除标记是由组蛋白乙酰 (HDACs) 和组蛋白 demethylases (HDMs) 分别为4、5。虽然这些蛋白质的存在几十年来已经知道, 许多机制的染色修饰机制如何工作, 以适当调节基因表达仍然有待确定。由于染色质调控过程在许多人类疾病中失调, 新的机械洞察可能会导致未来的治疗应用。
染色质在体内检测 (CiA) 是最近被描述的技术, 使用化学诱导剂接近 (CIP) 控制染色质修改机械招募到特定的轨迹6。该技术已被用来研究一个不断扩大的染色质动力学列表, 包括组蛋白修饰蛋白, 染色质 remodelers, 转录因子6,7,8,9。以 CIP 为基础的外部表达蛋白的染色质结合也被延长过去中情局通过使用与停用的群集定期 Interspaced 短回文重复 (CRISPR) 相关蛋白 (dCas9) 来调节非修饰的遗传基因座10,11. 在中情局系统中, mESCs 被修改为在Oct4轨迹上表达 GFP 报告基因, 这是卓制基因组高度表达和严格调控的区域。以前, 这个系统被应用来描述剂量依赖性和可逆的招募外部表达染色质蛋白 1 (HP1), 一种酶, 结合 H3K9me3 和传播压制标记 (如, H3K9me3) 和 DNA甲基化6。为了完成这种类型的招聘策略, mESCs 感染了一种质粒, 表达 FK506-binding 蛋白 (FKBP) 链接到 Gal4, 这是一个 DNA 蛋白锚绑定到一个 Gal4-binding 阵列上游的 GFP 记者。细胞也感染了 FKBP-雷帕霉素结合域 (FRB) 连接到 HP1。当 mESCs 暴露于低 nanomolar 浓度的 CIP, 雷帕霉素, 无论是 FRB 和 FKBP, 都聚集在一起的目标轨迹。在雷帕霉素治疗几天内, 通过荧光显微镜和流式细胞仪对靶基因的表达进行抑制, 并通过芯片和亚硫酸氢化序列显示组蛋白乙酰化的降低。虽然这种方法的发展和验证在染色质研究和调控领域取得了重大进展, 但其中一个缺点是染色质修饰机械所需的外源表达。
为了使这项技术的基础上只有内生生理相关的酶和制造一个更模块化的系统, 我们设计和特点新的双分子, 称为 CEMs (图 1)12。CEMs 的一个组成部分包括 FK506, 与雷帕霉素相似, 紧密结合, 专门 FKBP。因此, CEMs 仍将被招募到中央情报局 mESCs 的Oct4轨迹。CEMs 的其他成分是一种结合内源染色质修饰机械的基团。在一项试验性研究中, 我们测试了含有 HDAC 抑制剂的 CEMs。虽然使用抑制剂来招募 HDACs 的概念似乎是反直觉的, 但抑制剂仍然能够招募 HDAC 活动的基因感兴趣。这是通过 (1) 重定向 HDAC 到轨迹, 释放酶, 并增加不受抑制的 HDACs 在该地区的密度和 (2) 保持 HDAC 抑制在这个轨迹, 但招募压制性复合物, 约束 HDACs,或 (3) 两者的结合。在先前的一项研究中, 我们表明 CEMs 能够以剂量和时间依赖性的方式成功地压制 GFP 的记者, 并且以一种快速可逆的方式 (即在24小时内)12。我们以 qPCR6的荧光显微镜、流式细胞术和控制染色质环境的能力为特点, 提出了利用该技术控制基因表达的能力。在这里, 我们描述了一种使用和表征 CEMs 的方法, 这将促进该系统的适应性, 以回答与染色质生物学有关的其他问题。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了最近开发的杰姆系统是用来调节基因表达和染色质环境在特定的基因, 以剂量依赖性的方式。我们提供了一个准确的方法来研究调控基因表达的动态, 通过选择性地招募特定的内源性染色质调节蛋白。这是一种高度模块化的技术, 可用于研究不同的蛋白质和染色质修饰配合物在如何有效地调节染色质环境, 以及研究这些过程是如何失调的, 与实现基因特异性的好处。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢哈撒韦和金实验室的成员们的有益讨论。作者还感谢丹 Crona 和伊恩. 麦克唐纳对手稿的批判性阅读。这项工作部分是由美国国立卫生研究院授予 R01GM118653 (N.A.H.) 支持的;还有来自美国国立卫生研究院 (R01GM122749)、R01CA218600 和 R01HD088626 的赠款。这项工作还得到了3级的支持, 还有来自 Eshelman 创新研究所 (分别为 H 和上午 C) 的学生补助金。T-32 GM007092 (上午 C) 提供的额外资金支持这项工作。流式细胞术数据是在 unc 流式细胞术核心设施中获得的, 由 P30 CA016086 癌症中心核心支助赠款向 unc Lineberger 综合癌症中心提供资金。
Materials
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
Referenzen
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