Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia
Summary
Aquí presentamos una guía práctica de la construcción de un sistema de microscopía integrado, que combina la proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, proyección de imagen de una sola molécula basada en la detección de súper resolución y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de una sola molécula la proyección de imagen, en una puesta en marcha de una manera costo-eficiente.
Abstract
Microscopía de fluorescencia es una potente herramienta para detectar moléculas biológicas en situ y monitorear su dinámica y las interacciones en tiempo real. Además de microscopía de epifluorescencia convencional, han desarrollado varias técnicas de imagen para lograr objetivos experimentales específicos. Algunas de las técnicas ampliamente utilizadas incluyen la fluorescencia de una sola molécula resonancia transferencia de energía (smFRET), que puede reportar cambios conformacionales y las interacciones moleculares con la resolución del angstrom y basado en la detección de una sola molécula súper resolución (SR) la proyección de imagen, que puede mejorar la resolución espacial de aproximadamente diez a twentyfold comparado con microscopia de difracción limitada. Aquí presentamos un sistema integrado cliente-diseñado, que combina varios métodos de proyección de imagen en un microscopio, incluyendo proyección de imagen de epi-fluorescente convencional, una sola molécula basada en detección SR la proyección de imagen y detección de una sola molécula de varios color, incluyendo la proyección de imagen smFRET. Diferentes métodos de proyección de imagen pueden conseguirse fácilmente y reproducible elementos ópticos. Este montaje es fácil de adoptar por cualquier laboratorio de investigación en ciencias biológicas con la necesidad de rutina y diversos experimentos de imagen a un coste reducido y el espacio en relación con la construcción de microscopios distintos fines individuales.
Introduction
Microscopios de fluorescencia son herramientas importantes para la investigación de la ciencia biológica moderna y la proyección de imagen fluorescente se realiza de manera rutinaria en muchos laboratorios de biología. Por etiquetado de biomoléculas de interés con fluoróforos, directamente podemos visualizar al microscopio y registrar los cambios dependientes del tiempo en la localización, conformación, interacción y Asamblea estado in vivo o in vitro. Microscopios de fluorescencia convencionales tienen una resolución espacial limitada de la difracción, que es ~ 200-300 nm en la dirección lateral y ~ 500-700 nm en la dirección axial1,2y, por tanto, se limita a la proyección de imagen en el 100s de escala de nanómetros a micras. Para revelar los detalles más finos en el conjunto molecular o la organización, se han desarrollado diferentes Microscopias de SR que pueden romper el límite de difracción. Estrategias utilizadas para lograr SR incluyen efectos ópticos no lineales, como estimulante de la emisión (STED) el agotamiento microscopía3,4 e iluminación estructurada microscopia (SIM)5,6, 7, estocástico detección de moléculas individuales, como estocásticos reconstrucción óptica microscopia (tormenta)8 y fotoactivado localización microscopia (PALM)9y una combinación de ambos, como el MINFLUX10. Entre estas microscopías SR, microscopios de SR basados en la detección de una sola molécula relativamente fácilmente modificable de un montaje de microscopio de la solo-molécula. Con activación repetitiva y la proyección de imagen de photoactivatable de proteínas fluorescentes (FPs) o colorantes foto conmutable con la etiqueta de biomoléculas de interés, la resolución espacial puede llegar a 10-20 nm11. Para obtener información sobre las interacciones moleculares y conformacional dinámica en la resolución del angstrom a nanómetro, en tiempo real se requiere. smFRET12,13 es un método para lograr esta solución. En general, según las preguntas biológicas de interés, se necesitan métodos por imágenes con resoluciones espaciales diferentes.
Por lo general, para cada tipo de proyección de imagen, configuración óptica excitación o emisión específica es necesaria. Por ejemplo, uno de los métodos de iluminación más utilizadas para la detección de una sola molécula es a través de la reflexión interna total (TIR), en el que un ángulo de excitación específico debe conseguirse a través de un prisma o a través de la lente del objetivo. Para la detección de smFRET, emisiones de donador y aceptor tintes necesitan espacialmente separados y dirigidos a diferentes partes de la electrónica-multiplicar, dispositivo de carga acoplada (EMCCD), que se logra con un conjunto de espejos y divisores de haz dicroicos colocado en la trayectoria de la emisión. Para tridimensional (3D) SR la proyección de imagen, un componente óptico, como una lente cilíndrica14, es necesaria para causar un efecto de astigmatismo en la trayectoria de la emisión. Por lo tanto, construcción propia o microscopios integrados comercialmente disponibles, generalmente, funcionalmente especializados para cada tipo de método de la proyección de imagen y no son flexibles para cambiar entre diferentes métodos de proyección de imagen en la misma instalación. Aquí presentamos un sistema híbrido rentable, que ofrece interruptores ajustables y reproducibles entre tres métodos de proyección de imagen: proyección de imagen de epi-fluorescente convencional con resolución de difracción limitada, una sola molécula basada en la detección de SR proyección de imagen y detección de una sola molécula varios color, incluyendo smFRET proyección de imagen (figura 1A). En concreto, el montaje que presentamos contiene fibra-juntado entrados láseres para la excitación de varios color y un brazo de iluminación comercial en la ruta de la excitación, que permite programa el control del ángulo de excitación, para cambiar entre modo de epi y TIR. En la trayectoria de la emisión, un cassette de lente cilíndrica de homebuilt desmontable se coloca dentro del cuerpo del microscopio para obtener imágenes de SR 3D, y un divisor de viga comercial se coloca antes de una cámara EMCCD que puede activarse selectivamente detectar múltiples canales de emisión al mismo tiempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este sistema de microscopio híbrido elimina la necesidad de comprar varios microscopios. El costo total para todas las partes, incluyendo la tabla óptica, mano de obra de instalación tabla, software y estación de trabajo, es aproximadamente $230.000. Piezas mecanizadas de costumbre, incluyendo la lente de mag y lentes 3-d, cuestan alrededor de $700 (el costo depende de las cargas reales en diversos institutos). Típicos disponibles en el mercado sistemas integran para microscopia de SR basados en la detección de una…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. reconoce apoyo del programa de eruditos de Searle y Premio innovador del Director de los NIH. Los autores reconocen sugerencias útiles del laboratorio de Paul Selvin (Universidad de Illinois, Urbana-Champaign) para el posicionamiento de la lente 3D.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
Referenzen
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