IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik
Summary
Detaylı bir iletişim kuralı için bir altı-marker multiplex ayirt panel en iyi duruma getirilmiş ve gerçekleştirilen, daha tutarlı sonuçlar ve daha kısa işlem süresi için bir otomatik stainer kullanarak. Bu yaklaşım doğrudan IMMUNO-Onkoloji araştırmalar amaçlı herhangi bir laboratuvar tarafından adapte edilebilir.
Abstract
IMMUNO-Onkoloji devam eden gelişmeler kanser İmmünoloji mekanizmaları artan bir anlayış gerektirir. Doku örnekleri formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) biyopsi immunoprofiling analizini roman akıllı biyolojik kanserli hastalarda için keşfetmek ve tümör İmmünoloji karmaşıklığını anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Immunoprofiling analiz dokuların inflamatuar hücre altgrupları ve bağışıklık denetim noktaları, tümör microenvironment dahil olmak üzere birleştirilmiş işaretleyicilerin görünümünü değerlendirme gerektirir. Standart monoplex immünhistokimya (IHC) daha roman multiplex immunohistokimyasal yöntemleri gelişiyle tek doku bölümler daha verimli multiparametric analiz için izin verir. Yöntemi tyramide-sinyal güçlendirme üzerinde temel ve spektral mikroskobik analizi ile birlikte (), bir piyasada bulunan çok katmanlı ayirt doku çeşitli işaretlerinin daha iyi bir sinyal ayrılması için sağlar. Bu metodoloji FFPE doku örnekleri üzerinde standart IHC için optimize edilmiş çekimsiz birincil antikor kullanımı ile uyumludur. Burada biz ayrıntılı olarak multiplex sağlayan otomatik bir protokol Karsinomu doku örnekleri PD-L1, oluşan bir altı-marker multiplex antikor panel ile etiketleme tarif PD-1, CD68, CD8, Ki-67 ve AE1/AE3 cytokeratins ile 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole Nükleer hücre counterstain. Çok katmanlı masası iletişim kuralı bir otomatik IHC stainer bundan el ile iletişim kuralı daha kısadır ve doğrudan uygulanan ve herhangi bir laboratuvar araştırmacı IMMUNO-Onkoloji araştırmalar insan FFPE doku örneklerini tarafından uyarlanmış bir boyama süre için optimize edilmiştir. Ayrıca açıklanan çeşitli denetimler ve en iyi duruma getirme ve doğrulama tekniği için yararlı olan yeni bir multiplex Eğer panel iyi kalite kontrolü için bir damla-denetim yöntemi de dahil olmak üzere araçları vardır.
Introduction
Immunoprofiling analiz FFPE tümör doku örnekleri IMMUNO-Onkoloji çalışmaları, keşif ve Roman akıllı biyolojik kanserli hastalarda klinik1 bağlamında için doğrulama için özellikle önemli bir bileşeni haline gelmiştir ,2. Diaminobenzidine gibi kimyasal chromogens kullanarak chromogenic IHC standart tekniği biyopsi doku3immunolabeling için tanılama patoloji kalır. Standart IHC Nefelometri tümör ilişkili lenfosit altgrupları ve değerlendirme (PD-L1)4 programlı hücre ölümü ligand 1 gibi bağışıklık denetim noktaları ifade düzeylerinin de dahil olmak üzere kanser dokusu immunoprofiling için de kullanılabilir. ,5. Standart IHC ancak, içinde tek bir antijen doku bölüm başına etiketli sınırlıdır. İmmunoprofiling çalışmalar genellikle birkaç işaretleri kombine ifade analizini gerektirdiği için standart IHC kullanımı birden fazla doku bölümlerini boyama gerektirir, her tek bir marker ile lekeli ve bu nedenle, olur önemli ölçüde küçük doku örnekleri gibi çekirdek iğne biyopsileri analizi için sınırlı. Standart IHC yöntemleri de farklı hücre popülasyonlarının, PD-L1, tümör ilişkili makrofajlar ve kanser hücreleri tarafından ifade edildiği gibi bağışıklık denetim noktası işaretçileri olan ortak olduğu gibi tarafından coexpressed işaretleri değerlendirilmesi için sınırlıdır. Bu sınırlama standart monoplex IHC kullanımı, örneğin, farklı hücre türleri6tarafından ifade edilen bir IHC işaretleyici Nicel analiz patologlar tarafından bildirilmiştir. Her ne kadar onlar kalır aynı doku bölümü temsil üzerinde çeşitli renkli chromogens standart IHC monoplex yöntemi,7 üzerinde bir gelişme istihdam multiplex chromogenic IHC yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde, sadece bir kaç immunolabeling tarafından sınırlı işaretleri ve ayrıca aynı hücre popülasyonlarının aynı hücre altı bölmeleri içinde ifade işaretleri doğru değerlendirme için önemli bir teknik sorun mevcut.
Doku kullanılabilirlik klinik örnekleri yanı sıra multiplex chromogenic IHC teknikleri, sınırlamaları ile ilgili olarak yukarıda belirtilen uyarılar artış dayalı IMMUNO-Onkoloji çalışmaları için gelişmiş çok katmanlı yöntemler geliştirmek gerek verilen hiç Floresan etiketleme etkin bir şekilde birden fazla fluorophores sinyalleri aynı slayttan ayırabilirsiniz sistemleri Imaging ile birlikte. Böyle bir tekniği spektral mikroskobu görüntüleme için verimli renk ayrımı8ile birlikte tyramide sinyal güçlendirme (TSA) temel alır. Piyasada bulunan bir TSA tabanlı kiti spektral görüntüleme8 için en iyi duruma getirilmiş fluorophores istihdam ( Tablo malzemelerigörmek). Bu sistem bir kritik zaten doğrulanmış ve standart chromogenic IHC9,10,11için en iyi duruma getirilmiş aynı etiketlenmemiş birincil antikorlar ile uyumluluk avantajdır. Bu yeni hedefler birleştiren en iyi duruma getirme ve panel değişiklikleri sadece daha hızlı optimizasyonu aynı zamanda esneklik sağlar. Ayrıca, multiplex ayirt (mIF) TSA yöntemi bırakmak monoplex basit bir transfer için piyasada bulunan otomatik IHC stainer sistemler için optimize edilebilir chromogenic IHC Finans Yüksek Lisans için.
Burada temel IMMUNO-Onkoloji çalışmalar için bir MIF panel MIF TSA boyama otomatik ve görüntüleme için spektral bir tarayıcı kullanan bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı uyarlanmış ve açıklanan araçları ve Kimyasalları erişimi olan herhangi bir laboratuvar Kullanıcı tarafından değiştirilebilir. Protokol karsinomlar immunoprofiling için altı birincil antikorların bir panel içerir: PD-L1, PD-1, CD68 (olarak bir pan-makrofaj marker), CD8 (sitotoksik T hücreleri), Ki-67 ve AE1/AE3 (pan-cytokeratin epitel bir işaretleyici tanımlanması için kullanılan, Karsinomu Hücre). Yeni yapılan bir çalışmada12boyama multiplex doğrulamak için standart bir başvuru olarak chromogenic IHC kullanarak el ile bir TSA MIF protokol optimizasyon açıklar. Güncellenme Zamanı yöntemi burada sunulan büyük ölçüde kısaltılması da boyama tutarlılığını geliştirirken boyama zaman 3-5 gün 14 h, otomatik bir yapıcısı içinde en iyi duruma getirilmiş bir piyasada, yedi renkli TSA kiti kullanılarak geliştirilmiştir. Burada sunulan ayrıntılı ana protokolüne ek olarak bir Ek malzeme kısım “damla-control” yöntemi, yeni bir MIF panel yanı sıra optimizasyonu için teknik notlar değerlendirmek için bir ek kalite kontrol süreci içerir, sorun giderme ve laboratuvar Kullanıcı ayarlamak ve MIF TSA Yöntem özelleştirilmiş MIF panelleri için en iyi duruma getirmek için yardımcı olmak için yeni çok katmanlı paneller geliştirilmesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devam eden kanser immünoterapi devrim açılış roman ve umut verici olan kanser hastaları13için tedavi seçenekleri. IMMUNO-onkoloji alanında gelişmeler inflamatuar tümör microenvironment, sadece immünolojik mekanizmaların karsinojenezis içinde yer alan biyoloji anlamak için aynı zamanda akıllı biyolojik için yeni bulmak için artan bilgi gerektirir immünoterapi dayalı tedaviler1,2. Kanser İmmünoloji karmaşık biyoloj…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Editöryel destek MedImmune, Deborah Shuman tarafından sağlandı.
Materials
| "InForm 2.4.2" Software for Spectral Unmixing and Image Analysis | PerkinElmer | CLS151066 | Called "spectral unmixing software" in text |
| "Phenochart 1.0.9" QPTIFF Software for Selection of MSI and Overall Slide Scan Viewing | PerkinElmer | CLS151067 | Called "QPTIFF software" in text |
| #1.5 Coverslips | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-Buffered Saline | VWR | J640-4L | |
| Antibody Diluent | DAKO | S2203 | |
| Anti-CD68 Mouse Monoclonal | DAKO | M087601-2 | Clone PG-M1 |
| Anti-CD8 Rabbit Monoclonal | Ventana | M5392 | Clone SP239 |
| Anti-CK Mouse Monoclonal | DAKO | M351501-2 | Clone AE1/AE3 |
| Anti-ki67 Mouse Monoclonal | DAKO | M724001-2 | Clone MIB-1 |
| Anti-PD-1 Rabbit Monoclonal | Cell Signaling | #86163 | Clone D4W2J |
| Anti-PD-L1 Rabbit Monoclonal | Ventana | 790-4905 | Clone SP263 |
| Bond Dewax Solution | Leica | AR9222 | Called "dewax solution" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 1 | Leica | AR9961 | Called "ER1" in text |
| Bond Epitope Retrieval Solution 2 | Leica | AR9640 | Called "ER2" in text |
| Bond Open Containers, 30 mL | Leica | OP309700 | Called "30 mL open containers" in text |
| Bond Open Containers, 7 mL | Leica | OP79193 | Called "7 mL open containers" in text |
| Bond Polymer Refine Detection | Leica | DS9800 | Called "chromogenic detection kit" in text |
| Bond Research Detection Kit | Leica | DS9455 | Called "research detection kit" in text |
| Bond Titration Kit | Leica | OPT9049 | Called "titration kit" in text |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | Called "covertiles" in text |
| Bond Wash Solution 10X Concentrate | Leica | AR9590 | Called "10x wash solution" in text |
| BondRX Autostainer | Leica | Called "automated stainer" in text | |
| BondRX Software Version 5.2.1.204 | Leica | Called "automated stainer software" in text | |
| Opal 7-Color Automation IHC Kit | PerkinElmer | NEL801001KT | Called "multispectral staining kit" in text |
| Peroxidase Block | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo | P36965 | Called "slide mountant" in text |
| Starfrost Slides | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris Multispectral Microscope with "Vectra 3.0.5" Software for Multispectral Microscope Control | PerkinElmer | CLS143455 | Called "microscope control software" in text |
Referenzen
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient’s response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).
- Idikio, H. A. Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).
- Rebelatto, M. C., et al. Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma. Diagnostic Pathology. 11 (1), 95 (2016).
- Parra, E. R., et al. Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors. Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).
- Rehman, J. A., et al. Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer. Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).
- Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47 (2015).
- Granier, C., et al. Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment. Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48 (2018).
- Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. Unvalidated antibodies and misleading results. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).
- Baskin, D. G., Hewitt, S. M. Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society’s standards of practice. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).
- Freedman, L. P., et al. The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices. Biotechniques. 61 (1), 16-18 (2016).
- Hewitt, S. M. Reproducibility: it is just good science. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223 (2016).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
