رصد فرس النهر مما يشير إلى نشاط المسار باستخدام بيوسينسور القامع (لاتس لاتفيا) ورم كبير القائم على لوسيفراس
Summary
نقدم هنا بيوسينسور على أساس لوسيفراس لقياس نشاط كيناز القامع الورم كبير (لاتس لاتفيا)-كيناز مركزية في فرس النهر مما يشير إلى المسار. وقد بيوسينسور هذه التطبيقات المتنوعة في البحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات تهدف إلى بحث فرس النهر ممر المنظمين في المختبر و في فيفو.
Abstract
فرس النهر مما يشير إلى مسار منظم مصانة من حجم الجهاز ولديها أدوار هامة في بيولوجيا سرطان والتنمية. نظراً للتحديات التقنية، ما زال من الصعب تقييم نشاط هذا المسار إرسال الإشارات وتفسيرها في سياق بيولوجية. الكتابات الموجودة على القامع الورم كبير (لاتس لاتفيا) يعتمد على الأساليب النوعية ولا يمكن بسهولة أن تكون زيادة للفحص. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير biosensor المستندة إلى الإضاءة الحيوية لرصد النشاط كيناز لاتس لاتفيا-أ الأساسية المكون من تتالي كيناز فرس النهر. هنا، يمكننا وصف الإجراءات لكيف يمكن استخدام هذا بيوسينسور لاتس لاتفيا (لاتس لاتفيا-بكالوريوس) لتوصيف المنظمين المسار فرس النهر. أولاً، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتحقيق في تأثير مرشح البروتين أوفيريكسبريسيد (مثلاً، VEGFR2) في نشاط لاتس لاتفيا لاتس لاتفيا-البكالوريوس باستخدام. ثم نعرض كيف يمكن أن تستخدم اللاتس-البكالوريوس لشاشة المانع كيناز صغيرة. هذا البروتوكول يمكن عمليا رفع مستوى أداء شاشات أكبر، والتي ستحدد ولا شك أن المنظمين رواية المسار فرس النهر.
Introduction
فرس النهر مما يشير إلى مسار للمرة الأولى في المورفولوجية كمنظم رواية لنمو الخلايا، وحجم الحيوان1،2. منذ اكتشاف أولى، ثمة دلائل متزايدة مقنع أظهرت أن المسار فرس النهر تلعب أدواراً حاسمة في التنمية (مثلالتنمية الجنينية المبكرة، والتحكم في حجم الجهاز وثلاثي الأبعاد [ثلاثية الأبعاد] مورفولوجيا)، توموريجينيسيس ( مثلالورم، ورم خبيث، تولد الأوعية، ومحصنة ضد التهرب من دفع، عدم الاستقرار المجيني، إجهاد استجابة والتنمية والمقاومة للعقاقير)، والتوازن الأنسجة (مثلاً، تجديد الخلايا الجذعية والتمايز وتجديد الأنسجة بعد الإصابة) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10-إشارات فرس النهر هو في كثير من الأحيان dysregulated في مختلف أنواع السرطان7،،من89،10،11،12. ولذلك، توضيح وظائف المسار فرس النهر في بيولوجيا السرطان والمداواة والطب التجديدي قد أصبحت واحدة من المناطق الأكثر سخونة في البحوث الطبية الحيوية.
في موجز، في مسار فرس النهر، عند التنشيط بواسطة المنظمين المنبع (مثلاً، خلية خلية الاتصال والمغذيات الإجهاد والمصفوفة خارج الخلية [ECM])، مؤنزم MST1/2 (MST؛ homologs الثدييات من فرس النهر المورفولوجية ) سيرين/ثريونين (S/T) فوسفوريلاتي/تنشيط محول البروتينات hMOB1 و WW45، فضلا عن مؤنزم LATS1/2 (لاتس لاتفيا) التي، في وقت لاحق، فوسفوريلاتي المنشط المشارك النسخي ياب وفي بارالوج طاز في HX(H/R/K)XX(S/T) مصانة (ح، الحامض الأميني؛ البحث والتطوير، ارجينين؛ ك، يسين؛ S، سيرين؛ تي، ثريونين؛ X، أي الأحماض الأمينية) الزخارف، بما في ذلك11،S127 ياب وطاز-S8912. فوسفوريلاتيد S127 ياب (ياب-pS127) وفوسفوريلاتيد S89 طاز (طاز-pS89) التي تدهورت بسبب أوبيكويتيناتيون أو ربط البروتين هيولى 14-3-3 ويمنعون من التفاعل مع عوامل النسخ TEAD1-4 في النواة مجرى النهر ترانساكتيفاتي الجينات المعنية بتكاثر الخلايا والخلايا (الشكل 1). على الرغم من الاهتمام الهائل في مسار فرس النهر، يوجد عدد قليل من الأدوات لقياس الإشارات فرس النهر وتلك التي كانت محدودة تاريخيا للصحفيين إخراج النسخي ياب/تاز/تيد. وفي الواقع، حتى وقت قريب جداً، كانت هناك أية أدوات لقياس حيوية ونشاط لفرس النهر مما يشير إلى المكونات بطريقة كمية، في الوقت الحقيقي، والفائق، وغير الغازية في المختبر و في فيفوعلى حد سواء.
نظراً لدينا فهم دور تفاعلات البروتين البروتين في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الناشئة، هناك اهتمام كبير بتطوير الأدوات التي يمكن استخدامها لدراسة هذه التفاعلات في طريقة في الوقت الحقيقي والكمية13، 14،،من1516. وفي الواقع، كان هناك تقدما كبيرا في تطوير الاستراتيجيات الحيوية التحليلية، بما فيها (Y2H) اثنين-الهجين الخميرة17والسطحية مأكل مثل الطحين الرنين (موارد البرنامج الخاصة)18فورستر الرنين الطاقة نقل (بكى)19 معبراً، تقييم تفاعلات البروتين البروتين. ومع ذلك، تحمل هذه النهج الحد من التي تحتاج إلى التحسين الكبير لتوجه مراسل، مثل أنه يجب اختبار العديد من بنيات للعثور على عنصر كفاءة. علاوة على ذلك، قد هذه النهج أيضا نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة نسبيا، مثل أن المميزين إشارات إيجابية حقيقية يمكن أن يكون تحديا.
وقد وضعت فحوصات البروتين التكامل التغلب على هذه القيود. الجيل الأول من البروتين التكامل فحوصات تستند إلى تقسيم البروتينات الفلورية متعدد الألوان ولا يمكن أن يحل20من القيود المذكورة أعلاه. بروتينات فلورية متعدد الألوان تتكون من مجال واحد فقط، مما يجعل من الصعب على تقسيمها إلى اثنين من أجزاء منفصلة مستقرة مع تقارب منخفضة و الضوضاء الخلفية21. وفي وقت لاحق، تم تحديد لوسيفراس اليراع كمرشح جديد لاستخدامها في وضع انقسام البروتين التكامل فحوصات. في هذا النهج، يتم تقسيم لوسيفراس اليراع في الشظايا اثنين (لوسيفراس الطرفي ن والمحطة الطرفية ج [نلوك وكلوك]) مع كل جزء تنصهر فيها بروتين المستهدف للفائدة. إذا كان يوجه نلوك وكلوك إلى قرب عند تفاعل البروتينات المستهدفة اثنين، هو تشكيل النشاط لوسيفراس ويتم إنشاء ضوء طرحه حضور الركيزة لوسيفرين و ATP22. في عام 2001، عن طريق إجراء قطع اندماجي فرز باستخدام مكتبة تحتوي على شظايا نلوك وكلوك في مواقع مختلفة ويعلق على البروتينات مع linkers مختلفة، وضع باولموروجان ومحمد في جامعة ستانفورد تقسيم أمثل–اليراع لوسيفراس نظام التكامل ساعد جزء ل تفاعلات البروتين البروتين23. في هذا النظام، يتم قطع لوسيفراس اليراع في الحمض الأميني (أإ) 398 لتشكيل نلوك وكلوك، التي ترتبط البروتينات اثنين من اهتمام باستخدام رابط مرنة ثمانية جليكاين المخلفات وبقايا سيرين اثنين.
باستخدام نهج مماثل، وضعنا مؤخرا اللاتس جديدة-درجة بكالوريوس بالصمامات نلوك إلى 15 ألف ياب المحيطة بموقع الفسفرة لاتس لاتفيا في S127 (YAP15) وكلوك مع 14-3-3. ولم يستخدم البروتين ياب كاملة الطول، لتجنب الخلط إشارات بتعديلات بوستترانسلاشونال ياب (مثلاً، الفسفرة في مواقع أخرى وأوبيكويتيناتيون) من قبل المنظمين التمهيدية الأخرى. غير إينفاسيفيلي لاتس لاتفيا-BS المعروضة هنا يمكن رصد فرس النهر مما يشير إلى النشاط سواء في المختبر في الخلايا الحية و في فيفو في الفئران20،24 (الشكل 2). هنا، نحن وصف بروتوكول مفصل لقياس اللاتس كيناز النشاط في المختبر باستخدام لاتس لاتفيا-BS. أولاً، نحن إظهار كيف يمكن استخدام لاتس لاتفيا-البكالوريوس للتحقيق في تأثير البروتين أوفيريكسبريسيد على نشاط لاتس لاتفيا. ثم نعرض كيف يمكن استخدام في بيوسينسور لرصد نشاط المسار فرس النهر بعد العلاج مع وكلاء تنظم المسار فرس النهر. يمكن استخدام هذا البروتوكول تحديد وتوصيف إشارات المسارات أو المحفزات التي تنظم النشاط كيناز لاتس لاتفيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما المسار فرس النهر تلعب أدواراً حاسمة في مختلف العمليات البيولوجية، والتقلبات مسار فرس النهر يؤدي إلى السرطان6، كيف ينظم المسار فرس النهر في الاستجابة للمحفزات المختلفة ليست مفهومة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك لا نظام في الوقت الحقيقي والكمية لتقييم نشاط المكونات …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الكندي “البحوث الصحية” (استوفوا #119325، 148629) والكندي الثدي السرطان مؤسسة (كبكف) إلى س وص. تا معتمد من قبل فانييه كندا الدراسات العليا المنح الدراسية والمنح الدراسية الدراسات العليا الدولية أونتاريو. هجفر معتمد من قبل “الملكة إليزابيث الثانية خريج منحة دراسية” في مجال العلم والتكنولوجيا.
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
Referenzen
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
