Summary

Pez cebra adulto lesión modelos para estudiar los efectos de la prednisolona en regeneración de tejido óseo

Published: October 18, 2018
doi:

Summary

Aquí, Describimos 3 modelos de lesión del pez cebra adulto y su uso combinado con tratamiento inmunosupresor. Proporcionamos orientación en proyección de imagen de regenerar los tejidos y en la detección de la mineralización ósea en esto.

Abstract

Pez cebra son capaces de regenerar órganos diversos, incluyendo apéndices (aletas) después de la amputación. Se trata de la regeneración del hueso, que regrows en aproximadamente dos semanas después de lesión. Además, el pez cebra son capaces de curar hueso rápidamente después de la trepanación del cráneo y reparar las fracturas que pueden introducirse fácilmente en los rayos de aletas huesudas de pez cebra. Estos ensayos de lesiones representan posibles paradigmas experimentales para probar el efecto de drogas administradas en la rápida formación de hueso. Aquí, describimos el uso de estos modelos de 3 lesiones y su uso combinado con tratamiento con glucocorticoides sistémicos, que ejerce efectos inhibitorios e inmunosupresores hueso. Proporcionar un flujo de trabajo sobre cómo prepararse para el tratamiento inmunosupresivo en pez cebra adulto, ilustrar cómo realizar amputación de aleta, trepanación de los huesos calvarial y fracturas de la aleta y describen cómo el uso de glucocorticoides afecta ambos huesos formando osteoblastos y células del linaje monocito/macrófago como parte de la inmunidad innata en el tejido óseo.

Introduction

Pez cebra representan un poderoso modelo animal para estudiar enfermedades y del desarrollo de vertebrados. Esto es debido a que son pequeños animales que se reproducen muy bien y que su genoma completamente secuenciado y susceptibles de manipulación1. Otras ventajas incluyen la opción de realizar imágenes en continuo en diferentes etapas, incluyendo en vivo la proyección de imagen de pez cebra adulto2y la capacidad para realizar pantallas de drogas de alto rendimiento en larvas de pez cebra3. Además, pez cebra poseen una alta capacidad regenerativa en una variedad de órganos y tejidos incluyendo hueso y así servir como un sistema útil para estudiar enfermedad esquelética y reparar4,5.

Osteoporosis inducida por glucocorticoides (GIO) es una enfermedad que resulta del tratamiento a largo plazo con glucocorticoides, por ejemplo en el curso de tratamiento de enfermedades autoinmunes como asma o artritis reumatoide. GIO se desarrolla en aproximadamente el 30% de los pacientes tratados con glucocorticoides y representa un importante salud número6; por lo tanto, es importante investigar el impacto de la inmunosupresión en tejido óseo en gran detalle. En los últimos años se han desarrollado una variedad de modelos de pez cebra con la patogenesia de GIO. Pérdida de masa ósea mediada por los glucocorticoides ha sido inducida en pez cebra larvas, por ejemplo, que condujo a la identificación de los compuestos, aumentando la masa ósea en una droga pantalla7. Además, han sido mímico efectos inhibitorios ósea inducida por glucocorticoides en pez cebra escalas tanto in vitro e in vivode8,9. Estos ensayos son muy convincentes enfoques, especialmente cuando se trata de la identificación de nuevos fármacos inmunosupresores y hueso anabólicos. Sin embargo, sólo en parte tener en cuenta el endoesqueleto y no se ha realizado en un contexto regenerativo. Por lo tanto, no permiten la investigación de efectos mediada por glucocorticoides durante rápidos modos de formación de adultos, regenerador óseo.

Aquí, presentamos un protocolo permitiendo a los investigadores estudiar mediada por glucocorticoides efectos sobre los huesos de pez cebra adulta experimentando regeneración. Modelos de lesión incluyen la amputación parcial de la aleta caudal de pez cebra, trepanación del cráneo, así como la creación de las fracturas fin ray (figura 1A-1 C) y se combinan con glucocorticoides exposición por medio de incubación (Figura 1E ). Recientemente hemos utilizado una parte de este protocolo para describir las consecuencias de la exposición a la prednisolona, uno de los fármacos corticosteroides comúnmente prescritos, en pez cebra adulto regenerar aletas y cráneo hueso10. En el pez cebra, administración de prednisolona conduce a disminución de osteoblastos proliferación, la diferenciación osteoblástica incompleta y rápida inducción de la apoptosis en el linaje monocito/macrófago del10. En este protocolo, también describimos cómo las fracturas pueden ser introducidas en sola aleta huesuda ray segmentos11, como este enfoque puede ser útil al estudiar mediada por glucocorticoides efectos sobre hueso que se produce durante la reparación de la fractura. Los métodos presentados aquí ayudarán a otra dirección subyacen mecanismos de acción glucocorticoide en rápidamente la regeneración del hueso y también pueden ser empleados en otros entornos de administración sistémica en el contexto de la regeneración de tejido de pez cebra.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el Landesdirektion Dresden (permitir números: AZ D 24-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, 24-9168.11-1/2013-5 de AZ, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87). 1. preparación de materiales y soluciones Nota: Prednisolona, como otros glucocorticoides, conduce a la inmunosupresión. Por lo tanto, deben tomarse precauciones para prevenir la infección en animales tratados durante el experimento. A est…

Representative Results

El protocolo presentado aquí se ha utilizado repetidamente para inducir la formación ósea rápida en el curso de regeneración del pez cebra aleta y cráneo10,11,16. En combinación con el método actual de la administración de prednisolona, estudios sobre los efectos de la prednisolona durante la regeneración ósea pueden ser perseguidos. Por ejemplo, se pueden realizar estudios sobre la fo…

Discussion

Pez cebra han demostrado utilidad en la investigación esquelética en muchos aspectos. Las mutantes imitan aspectos de la enfermedad humana como la osteogénesis imperfecta o artrosis23,24,25,26,27y larvas así como escalas se utilizan para identificar compuestos anabólicos óseos en moléculas pequeñas pantallas7,<sup cla…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por una beca de la centro de regenerativa terapias Dresden (“pez cebra como modelo para desentrañar los mecanismos de pérdida de masa ósea inducida por glucocorticoides”) y además por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (67 Transregio, proyecto 387653785) de FK. Estamos muy agradecidos a Jan Kaslin y Avinash Chekuru por su orientación y ayuda en realizar trepanaciones de los calvariae y fracturas en los radios de la aleta huesuda. Experimentos fueron diseñados, realizados y analizados por KG y FK. FK escribió el manuscrito. También nos gustaría agradecer a Katrin Lambert, Nicole Cudak y otros miembros de los laboratorios de Knopf y marca para asistencia técnica y de discusión. Nuestro agradecimiento también va a Marika Fischer y Jitka Michling para el cuidado de excelentes pescados y a Henriette Knopf y Josh Currie para corregir el manuscrito.

Materials

Prednisolone Sigma-Aldrich P6004
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich A5040
Blunt forceps Aesculap BD027R
Fine forceps Dumont 91150-20
Scalpel Braun 5518059
Agarose Biozym 840004
Injection needle (0.3×13 mm) BD Beckton Dickinson 30400
Micro drill Cell Point Scientific 67-1000 distributed e.g. by Harvard Apparatus
Steel burrs (0.5 µm diameter) Fine Science tools 19007-05
Artemia ssp. Sanders 425GR
Pasteur pipette (plastic, Pastette) Alpha Labs LW4111
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Alizarin red S powder Sigma-Aldrich A5533
Alcian blue 8 GX Sigma-Aldrich A5268
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Trypsin Sigma-Aldrich T7409
Stereomicroscope Leica MZ16 FA with QIMAGING RETIGA-SRV camera
Stereomicroscope Olympus MVX10 with Olympus DP71 or DP80 camera

Referenzen

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Geurtzen, K., Knopf, F. Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue. J. Vis. Exp. (140), e58429, doi:10.3791/58429 (2018).

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