Hier beschrijven we twee nieuwe methoden van stabiele intranasale toediening onder inademing verdoving met minimale fysieke stress voor proefdieren. Ook beschrijven we een methode voor kwantitatieve beoordeling van drug distributie niveaus in de hersenen via de neus-aan-hersenen pathway met behulp van radiolabeled [14C]-inuline als model substraat van in water oplosbare macromoleculen.
Intranasale toediening is gemeld als een mogelijke weg voor de neus-naar-brain levering van therapeutische agenten die de bloed – hersenbarrière omzeilt. Echter zijn er enkele verslagen met betrekking tot niet alleen de kwantitatieve analyse, maar ook het beheer van de optimale voorwaarden en dosering van regimes voor onderzoek van de neus-naar-brain levering. De beperkte vooruitgang in onderzoek naar mechanismen van de neus-naar-brain traject met behulp van knaagdieren vertegenwoordigt een aanzienlijke belemmering op het gebied van het ontwerpen van de neus-naar-brain afgiftesystemen voor kandidaat-drugs.
Om te krijgen wat vooruitgang in dit opzicht, wij ontwikkeld en geëvalueerd van twee nieuwe methoden van stabiele intranasale toediening onder inademing verdoving voor proefdieren. Ook beschrijven we een methode voor de beoordeling van de drug distributie niveaus in de hersenen via de neus-aan-hersenen pathway met behulp van radio-geëtiketteerden [14C]-inuline (moleculair gewicht: 5.000) als substraat model van in water oplosbare macromoleculen.
Aanvankelijk, ontwikkelden we een pipet gebaseerde intranasale administratie-protocol met behulp van tijdelijk openable maskers, waardoor ons voor het uitvoeren van betrouwbare toediening aan dieren onder stabiele verdoving. Met behulp van dit systeem, [14C]-inuline kon worden verstuurd naar de hersenen met weinig experimentele fout.
Later ontwikkelden we een intranasale toediening protocol inhoudt van omgekeerde cannulation van de kant van de luchtwegen door de slokdarm, die werd ontwikkeld om te minimaliseren van de effecten van mucociliary klaring (MC). Deze techniek heeft geleid tot aanzienlijk hogere niveaus van [14C]-inuline, die kwantitatief werd ontdekt in de bulbus olfactorius cerebrum en de medulla oblongata, dan de pipetteermethode. Dit lijkt te zijn omdat de handhaving van de drug-oplossing in de neusholte werd aanzienlijk verhoogd door actieve administratie met behulp van een injectiespuit pomp in een richting tegenovergesteld aan de MC in de neusholte.
Kortom, de twee methoden voor intranasale toediening ontwikkeld in deze studie kunnen worden verwacht dat uiterst nuttige technieken voor de beoordeling van de farmacokinetiek bij knaagdieren. De omgekeerde cannulation methode, in het bijzonder zou kunnen nuttig zijn voor de beoordeling van het volledige potentieel van de neus-naar-brain levering van drugkandidaten.
Biomedicines zoals peptiden, oligonucleotides en antilichamen worden beschouwd als potentiële toepassing als nieuwe therapeutische agenten voor vuurvaste centraal zenuwstelsel-stoornissen die momenteel geen curatieve therapie hebben. Omdat de meeste biomedicines wateroplosbaar macromoleculen zijn, is levering uit het bloed naar de hersenen via de intraveneuze of orale toediening echter zeer moeilijk als gevolg van de impedantie van de bloed – hersenbarrière (BBB).
In de afgelopen jaren is intranasale toediening gemeld als een mogelijke weg voor de neus-naar-brain levering van therapeutische agenten die de BBB1,2,3,4,5 vermijdt. Er zijn echter relatief weinig meldingen met betrekking tot de kwantitatieve analyse van neus-aan-hersenen pathway levering6. Bovendien zijn er vrijwel geen verslagen over vastgestelde optimale administratie voorwaarden en doseren regimes, zoals volume, times, periodes, en snelheid, voor onderzoek van de neus-naar-brain levering. De genoemde tekortkomingen kunnen worden toegeschreven aan de volgende redenen: (i) een optimale wijze van intranasale toediening voor muizen nog moet worden vastgesteld, en (ii) intranasale toediening door pipetteren, die over het algemeen wordt gebruikt, wordt doorgaans gekenmerkt door de variatie van de interindividual onder de dieren als gevolg van mucociliary klaring (MC), waardoor het vaak leidt tot underestimations van het potentieel van de feitelijke levering van neus-tot-brein van een bepaald geneesmiddel.
Inademing verdoving met behulp van Isofluraan (Inleiding: 4%, onderhoud: 2%) met een inademing masker voor knaagdieren heeft opgedaan wijdverbreide gebruik, met het doel van het verminderen of elimineren van de pijn geassocieerd met chirurgie uitgevoerd op proefdieren. Het gebruik van maskers maakt het relatief eenvoudig om uit te voeren van typische drug administration bij proefdieren onder inademing verdoving via de subcutane, intraperitoneaal en intraveneuze routes. In het geval van intranasale toediening moet het masker echter worden tijdelijk verwijderd uit de dieren voor drug administration. Met onderhoud onder 2% Isofluraan, dieren meestal ontwaken snel van inademing verdoving. Wanneer het volume van de administratie per dosis groot is, hierdoor kan de oplossing van de drug van de neusholte stromen naar de slokdarm, en dus een enkele grote dosis wellicht worden opgesplitst in meerdere kleinere doses voor intranasale toediening aan kleine dieren. Zoals intranasale toediening noodzakelijk masker verwijderen voor herhaalde toediening en voldoende tijd voor duurzame neusholte levering is, is er een grote kans dat muizen van verdoving tijdens de administratieve procedures ontwaken zou. Dit maakt het erg moeilijk om uit te voeren intranasale toediening onder een stabiele toestand van verdoving, en waarschijnlijk draagt bij tot de waargenomen interindividual variatie van de neus-naar-brain levering onder knaagdieren.
In deze studie ontwikkeld wij daarom twee nieuwe methodes van stabiele intranasale toediening onder inademing verdoving, die minimale fysieke belasting van de proefdieren opleggen. Voor de eerste methode gebruikten we een tijdelijk openable masker waarmee intranasale toediening tijdens inademing verdoving. Het openable gedeelte van het masker bevat een siliconen plug die om stabiele intranasale toediening met behulp van een precisiepipet overeenkomstig administratie timing kan worden gebruikt. Voor de tweede methode, een canule is operatief ingevoegd om het passeren van de slokdarm in de neusholte en een spuitpomp werd vervolgens gekoppeld aan dit zodat de drug oplossing kon worden direct en betrouwbaar bezorgd in de neusholte onder stabiele inademing anesthesie. Deze methode kan het verbeteren van de levering van drugs in de hersenen via de neus-naar-brain-route, omdat door het aanzienlijk het minimaliseren van de effecten van MC, drug retentively in de neusholte zou worden verbeterd. Daarnaast beschrijven we een methode voor het uitrekenen kwantitatief drug distributie niveaus (% voor de ingespoten dosis/g hersenen) in de hersenen met behulp van radio-geëtiketteerden [14C]-inuline [molecuulgewicht (MW): 5.000] als een model substraat van in water oplosbare macromoleculen.
De neus-naar-brain levering van drugs naar verwachting hebben een uitgesproken invloed op het centrale zenuwstelsel-stoornissen omdat dit traject vertegenwoordigt een rechtstreekse vervoer route die rondwegen van de BBB. Drie verschillende routes van de neus-naar-brain zijn bij datum8gemeld. De eerste is de bulbus zenuwtraject, die van de olfactorische mucosa in de nasale mucosa naar de reukkolf via de bulbus zenuw loopt. De tweede is het pad van de nervus trigeminus, die van de respiratoire mucos…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de particuliere universiteit Branding onderzoeksproject van MEXT; een Grant-in-Aid voor wetenschappelijke Research (C) (17 K 08249 [naar T.K. en T.S.]) van de Japan Society voor de bevordering van de wetenschap (JSPS); een subsidie voor coöperatief onderzoek van de Hamaguchi-Stichting voor de vooruitgang van Biochemie [naar T.S.], en de Takeda Science Foundation [naar T.K.]. Wij danken de heer Yuya Nito en Ms. Akiko Asami voor hun waardevolle technische bijstand bij de uitvoering van de experimenten.
ddY mouse | Japan SLC, Inc. | Male, 4-6 weeks, 20-30 g | |
Isoflurane | Pfizer | v002139 | |
Isoflurane setup | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-OTAir, SN-489-4 | |
Isoflurane mask | SHINANO manufacturing CO. LTD. | For small rodents | |
Isoflurane mask (Opneable type) | SHINANO manufacturing CO. LTD. | Special orders | |
Anesthesia Box | SHINANO manufacturing CO. LTD. | SN-487-85-02 | |
Animal experiments scissors-1 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-27H | |
Animal experiments scissors-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | B-13H | |
Tweezers-1 | FINE SCIENCE TOOLS Inc. | 11272-30 | Dumont #7 Dumoxel |
Tweezers-2 | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | A-12-1 | |
Cannula tube (PE-50) | Becton, Dickinson and Company. | 5069773 | I.D.: 0.58 mm, O.D.: 0.965 mm |
Cannula tube (SP-10) | NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD. | KN-392 | I.D.: 0.28 mm, O.D.: 0.61 mm |
Shaver | MARUKAN, LTD. | DC-381 | |
Stereoscopic microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
Needle 27G 1/2 in 13 mm | TERUMO CORPORATION | NN-2738R | |
1 mL syringe | TERUMO CORPORATION | SS-01T | |
Syringe pump | Neuro science | NE-1000 | |
Cellulose membrane | Toyo Roshi Kaisya, Ltd. | 00011090 | |
Micro spatula | Shimizu Akira Inc. | 91-0088 | |
Micropipette (0.5-10 uL) | Eppendorf AG | Z368083 | |
Pipette chip | Eppendorf AG | 0030 000.811 | |
Tape | TimeMed Labeling System, Inc. | T-534-R | For fixing mouse |
[14C]-Inulin | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ARC0124A | 0.1 mCi/mL |
EtOH | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 054-00461 | |
Liquid scintillation counter | Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc | Tri-Carb 4810TR |