体液性免疫のキープレーヤーの解明: 高度なマウス Peyer のパッチからのリンパ球の隔離のプロトコルを最適化
Summary
本研究で提案する小説とリンパ球の隔離のための効果的なプロトコル卵胞 T の流れフローサイトメトリーによる調査と同様に、体内と体外の機能アッセイにその後使用できますパイエル パッチ (PPs) からヘルパーおよび胚中心 B 細胞。
Abstract
消化管粘膜の免疫細胞は、病原体に対する免疫防御を同時に付与しながら免疫寛容を促進するユニークな免疫学的実体を構成します。まあ、パイエル板 (PPs) がいくつかのエフェクター T および B 細胞のサブセットをホストすることによって粘膜免疫ネットワークの重要な役割をあることを設立します。これらのエフェクター細胞、卵胞の T ヘルパー (TFH) および (GC) 胚中心 B 細胞のある特定の一部分は、体液性免疫の調節に professionalized します。したがって、PPs 内の分化プログラムと機能性の面でこれらの細胞のサブセットの特性は、粘膜免疫に関する重要な情報を提供できます。このため、簡単に適用可能な効率的な再現性のある PPs からのリンパ球分離法は研究者に有益でしょう。本研究では細胞の高安マウスからリンパ球を分離するための効果的な方法を生成する目的とします。我々 のアプローチの処理消化試薬と組織の動揺の使用など、初期組織を明らかと同様、細胞染色条件と抗体パネルの選択、品質と分離リンパ球のアイデンティティに大きな影響を与える実験結果。
ここでは、効率的に再現性のある流れ cytometry TFH と GC B 細胞サブセットに主に焦点を当て、T および B 細胞のサブセットの評価を許可する PPs からリンパ球集団を隔離して研究者を有効にするプロトコルについて述べる。
Introduction
最後に、最初から全体の消化管はよりも他の人間の器官とマウス1免疫細胞を含むリンパ網で飾られて。Peyer のパッチ (PPs) は、この細胞の免疫組織、いわゆる腸管関連リンパ性ティッシュ (GALT)2,3の腸の枝の主要なコンポーネントを構成します。PPs、食材由来の抗原の数百万の何千もの内で共生微生物叢と病原体が連続的にサンプルされているし、それらに向かって必要な適切な免疫応答がマウントされた維持腸管免疫恒常性。その意味で、PPs は「小腸の扁桃」として名前可能性があります。PPs から成っている主要な小班: 上皮下ドーム (SED) 大規模な B 細胞濾胞ゾーン;T 細胞がある4を覆う濾胞関連上皮 (FAE) と胞間領域 (IFR)。協力する PPs により異なるエフェクター細胞のサブセットのこのユニークな区画は、したがって、腸内免疫を与えます。
PPs 求心性リンパ管の欠如し、この理由のため小腸から PPs に運ばれる抗原は他のリンパ器官のほとんどと対照をなしてリンパ管を介して行われているないです。代わりに、FAE、いわゆる M 細胞にある特殊な上皮細胞が PPs5への抗原の転送を担当します。その後、運ばれた抗原は、樹状細胞 (Dc) によって拾われますと FAE6,7下上皮ドーム (SED) 地域にある食。PP で DCs によって、この抗原並べ替えプロセスは適応免疫応答8および IgA 産生細胞9の次の世代を開始することが重要です。
共生植物や食材から抗原上負担による PPs ホスト内生と活性化エフェクター T TFH と伊賀+ GC B 細胞10など大きな元素に B 細胞サブセット PPs 表すアクティブな免疫のサイトであることを示唆しています。応答11。20-25% の検出 TFH セル合計 CD4 内+ T 細胞のコンパートメントとを GC B 細胞, B 細胞内で 10-15% に採集された unimmunized 若い C57BL/6 マウス12PPs で可能です。他の T ヘルパー細胞型とは対照的 (すなわち。、Th1、Th2、Th17 細胞)、TFH 細胞 CXCR5 式 CXCL13 勾配13に沿って TFH 細胞のホーミングを促進するため主に B 細胞濾胞にユニークな親和性を示します。PPs の B 細胞濾胞ゾーン、TFH 細胞誘導を誘導する IgA クラス スイッチ組換え活性化 B 細胞の高親和性 IgA を生産細胞分化14で体性 hypermutation。その後、これらの抗体分泌形質細胞は粘膜 (LP) に移行し、腸10免疫恒常性を調節します。
PPs 内 TFH と GC B 細胞集団の同定と解析は、時間のかかる免疫モデルを必要とせず定常条件の下で液性免疫応答の動態を調査する研究者を可能にするかもしれないTFH GC B 細胞研究15,16,17,18で伝統的に使用。PPs 内 TFH 細胞を解析は他の細胞のサブセットと同様に簡単ではありません。技術的な課題には、理想的な組織の準備条件、表面マーカー抗体の組み合わせを識別するだけでなく、適切な正と負のコントロールを選択することが含まれます。TFH と PP の研究分野では、実験手続きの面で大きな変動性を示すし、いくつかの理由のために標準化されたプロトコルを確立する合意を授与から遠く離れています。まず、PPs 内各細胞のサブセットは、特異的細胞サブセット固有の方法でさらに変更を必要とする組織調製条件の影響を受ける傾向があります。第二に、安第三に、理想的な組織調製技術と実験条件調査プロトコル ベースの比較研究の数からのセルの準備の詳細について報告の方法の間で大きな差異があります。PP と TFH の研究はかなり限られています。
TFH や B 細胞指向 GC、PP 細胞調製19,20,21,22の提案した現在のプロトコル ベースの研究はありませんでした。さらに、PPs19,20コラゲナーゼ ベースの消化などをお勧めしますいくつかの組織調製条件がフローサイトメトリーによる TFH 同定の結果に悪影響を与える判明した18。これに基づき、私たちは PPs 内 TFH と GC B の細胞動態を研究するために使用できる最適化された、標準化された、再現性のあるプロトコルがこのトピックに取り組んでいる研究者に価値があると判断。この必要性は私たちの分離と細胞回復、生存率、およびいくつかの T および B の流れフローサイトメトリー評価の効率を最適に細かく PP リンパ球の特性の改善と最新プロトコルを生成するきっかけとなった細胞サブセット。また、必要な操作と PPs から組織・細胞の準備のための時間を減らすことにより、以前のプロトコルで提案されているいくつかの面倒な準備手順を除外する目指しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、TFH および GC B 細胞の流れフローサイトメトリー評価のために最適化されたプロトコルについて述べる。プロトコルの主要な利点の 1 つは、任意の消化プロセスがなければ最大 107 (平均 4-5 x 10 の6セル) 単一のマウス (C57BL/6 ひずみ) から合計 PP 細胞の分離できます。総細胞収量が PPs の数と正の相関は、実験計画のために有用である次の単純な式から推定することが?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
役に立つ議論のローラ シュトラウス、ピーター ・ セージを感謝し、フローサイトメトリー解析でサポートしたいと思います。
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
Referenzen
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