In Vitro Méthode de contrôle des Concentrations de gaz halogénés en cellules épithéliales alvéolaires
Summary
Les auteurs décrivent un protocole facile, spécialement conçu pour atteindre des concentrations précises et contrôlées du sévoflurane ou isoflurane le in vitro afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans les lésions épithéliales pulmonaires et de tester les roman traitements pour le syndrome de détresse respiratoire aiguë.
Abstract
Syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est un syndrome d’une blessure alvéolaire diffuse avec dégagement de fluide alvéolaire avec facultés affaiblies et une inflammation sévère. L’utilisation d’agents halogénés, comme sévoflurane ou isoflurane, pour la sédation des patients de l’unité de soins intensifs (USI) peut améliorer les échanges gazeux, réduire l’oedème alvéolaire et atténuer l’inflammation au cours du SDRA. Cependant, manque des données sur l’utilisation des agents inhalés pour la sédation continue en réanimation pour traiter ou prévenir les dommages aux poumons. Afin d’étudier les effets des agents halogénés sur les cellules épithéliales alvéolaires dans des conditions « physiologiques », nous décrire un système facile à des cellules de culture à l’interface air-liquide et de les exposer à des agents halogénés pour fournir des fractions précis contrôlé « air » et concentrations de « moyen » pour ces agents. Nous avons développé une chambre hermétique scellée dans laquelle plaques avec des cellules immortalisées épithéliales alvéolaires humaines pourraient être exposés à une fraction précise et contrôlée du sévoflurane ou isoflurane en utilisant un flux de gaz en continu fourni par un circuit de la machine anesthésique. Les cellules ont été exposés à 4 % de sévoflurane et 1 % d’isoflurane pendant 24 heures. Spectrométrie de masse de gaz a été réalisée afin de déterminer la concentration des agents halogénés dissous dans le milieu. Après la première heure, la concentration de sévoflurane et isoflurane dans le milieu ont été 251 mg/L et 25 mg/L, respectivement. Les courbes représentant la concentration de sévoflurane et isoflurane dissolvent dans le milieu ont montré des cours similaires au fil du temps, avec un plateau à une heure après l’exposition.
Ce protocole a été spécialement conçu pour atteindre des concentrations précises et contrôlées de sévoflurane ou isoflurane in vitro afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans les lésions épithéliales pulmonaires au cours du SDRA et de tester de nouveaux traitements pour les syndrome.
Introduction
Syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est un syndrome clinique caractérisé par des lésions alvéolaires diffuses, œdème pulmonaire et une insuffisance respiratoire hypoxémie. Bien que SDRA représente plus de 10 % des admissions de l’unité de soins intensifs (USI) et près de 25 % des patients ICU nécessitant une ventilation mécanique, c’est toujours un défi sous-diagnostiquée pour les cliniciens, avec un taux de mortalité de l’hôpital de 35 à 45 %1. Malgré d’intenses recherches, l’identification d’un traitement pharmacologique efficace SDRA ou la prévention a échoué jusqu’à présent. Deux principales caractéristiques contribuent à la mortalité en SDRA : malentendants jeu fluide alvéolaire (AFC) (c.-à-d., la résorption altérée du liquide d’oedème alvéolaire d’espaces d’air pulmonaire distale) et une inflammation sévère2. Puisque ARDS de mortalité demeure élevé, initiatives actuelles devraient également inclure la prévention primaire ; Cependant, des principaux défis sont d’identifier les patients à risque dans lesquels SDRA est susceptible de se transformer et qui bénéficieraient si SDRA ont été empêché.
Les anesthésiques halogénés volatils, comme le sévoflurane et isoflurane, sont largement utilisés pour fournir une anesthésie générale au bloc opératoire. Dans le monde entier, plus de 230 millions de patients subissant une intervention chirurgicale majeure chaque année nécessitent une anesthésie générale et ventilation mécanique3, et des complications pulmonaires postopératoires altèrent les résultats cliniques et l’utilisation de soins de santé4 . L’utilisation de sévoflurane au lieu de propofol a été associée à l’inflammation pulmonaire améliorée chez les patients subissant une chirurgie thoracique et une diminution significative des événements indésirables, tels que l’ARDS et complications pulmonaires postopératoires5. De même, un prétraitement à l’isoflurane a des effets protecteurs sur la mécanique respiratoire, l’oxygénation et l’hémodynamique dans des modèles animaux expérimentaux de SDRA6,7. Bien que d’autres études sont garantis d’examiner l’incidence des agents inhalés sur les résultats en chirurgie thoraciques, une diminution des complications pulmonaires similaire a été observée récemment dans une méta-analyse, démontrant que par inhalation des agents anesthésiques — comme opposé à l’anesthésie intraveineuse — sont significativement associée à une réduction de la mortalité pour la chirurgie cardiaque,8.
Les données prospectives spécifiques sur l’utilisation des agents volatils pour la sédation des patients ICU pour prévenir ou traiter des lésions pulmonaires sont absent. Toutefois, plusieurs essais prennent désormais en charge l’efficacité et l’innocuité du sévoflurane inhalée pour la sédation des patients ICU, et les études précliniques ont montré que le sévoflurane inhalée et isoflurane7,9 améliorer les échanges gazeux, réduire oedème alvéolaire et atténuer l’inflammation dans des modèles expérimentaux de SDRA. En outre, sévoflurane atténue type II cellules épithéliales dommages10, tandis qu’isoflurane maintient l’intégrité de la barrière alvéolo-capillaire par la modulation des protéines de jonction serrée11. Toutefois, les autres études sont nécessaires pour vérifier dans quelle mesure les preuves expérimentales de protection orgue de sévoflurane inhalée et isoflurane peuvent se traduire pour l’être humain. Un premier single-Centre contrôlée-essai randomisé (ECR) de notre groupe ont découvert que l’utilisation précoce de sévoflurane inhalé chez les patients atteints de SDRA et oxygénation améliorée, réduction des taux de certains marqueurs pro-inflammatoires et pulmonaire réduite épithéliales dommage, tel qu’évalué par le niveau de la forme soluble du récepteur pour produits de glycation avancée (iniriale) dans le plasma et alvéolaire fluide12.
Pris ensemble, les effets bénéfiques de sévoflurane et isoflurane sur lésion pulmonaire peuvent pointer vers plusieurs voies biologiques ou les processus fonctionnels qui dépendent de la voie de la RAGE, à savoir jeu fluide alvéolaire (AFC), des lésions épithéliales, la translocation du facteur nucléaire (NF)-κB et l’activation des macrophages. En outre, sévoflurane peut influencer l’expression de la protéine RAGE lui-même. Étant donné que des recherches antérieures par notre équipe de recherche et d’autres prend en charge un rôle essentiel pour la RAGE en inflammation alvéolaire et poumon épithéliales blessure/réparation au cours du SDRA, nous avons conçu un modèle expérimental pour fournir une compréhension translationnelle des mécanismes de sévoflurane en poumon dommage et réparation13,14,15. Les effets in vitro de sévoflurane et isoflurane ont été étudiés en ligne roman humaine alvéolaire primaire des cellules épithéliales, spécifiquement conçue pour étudier la barrière air-sang du poumon périphérique, hAELVi (humain LentiVirus épithélial alvéolaire immortalisée), présentant des caractéristiques de j’ai-comme de type alvéolaire dont des jonctions serrées fonctionnelles16.
Tout en préparant la conception de nos recherches in vitro (p. ex., cultures de cellules épithéliales alvéolaires à l’interface air-liquide avec l’exposition « inhalation » sévoflurane ou isoflurane, nous avons compris dès inédit qui étudie fractions de sévoflurane ont seulement été évaluées dans le « air » interface17,18,19 à l’aide de moniteurs standard (similaires à celles utilisées en milieu clinique). Concentrations d’agent halogénés ont été choisies généralement selon les valeurs de concentration alvéolaire minimale (MAC) (par exemple, chez l’homme, pour le sévoflurane, 0,5 1,1 et vol 2,2 %, ce qui représente 0,25, 0,5 et 1 MAC, respectivement ; pour l’isoflurane, 0.6, 0.8, et 20de vol 1,3 % ce qui représente 0,25, 0,5 et 1 MAC, respectivement). En effet, concentration de sévoflurane et isoflurane ont jamais été étudiées dans le milieu de culture lui-même, ce qui limite la validité des anciens modèles expérimentaux/instruments. En outre, la plupart des expériences utilisés pot d’anaérobie qui a été scellé après que le sévoflurane contenant de mélange air avait été vidée à l’intérieur. Comme notre but était d’étudier les cellules épithéliales alvéolaires dans des conditions « physiologiques », nous avons cru que tel un État anaérobie n’est peut-être pas optimale et qu’il ne serait pas compatible avec des durées longues expérimentales. Donc, nous avons développé notre propre système de cellules en culture à l’interface air-liquide et de les exposer aux agents halogénés (sévoflurane et isoflurane) dans le but de fournir des fractions « aérien » contrôlé précis et des concentrations « moyen » pour ces agents. À notre avis, cette étape expérimentale, qui n’a pas été signalée à ce jour dans la littérature, est obligatoire avant toute autres investigations in vitro de sévoflurane et isoflurane.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre protocole décrit une méthode simple pour exposer les cellules à une fraction précise d’un agent anesthésique halogéné, comme sévoflurane ou l’isoflurane. En outre, nous rapportons ici — pour la première fois — une corrélation rigoureuse entre la fraction de gaz et la concentration de sévoflurane et isoflurane à l’intérieur du milieu de culture lui-même. Cette étape fondamentale permet maintenant d’utiliser en toute sécurité notre chambre étanche à l’air pour étudier les effets de c…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Conseil régional d’Auvergne (« Programme Nouveau Chercheur de la Région Auvergne » 2013) et le Français Agence Nationale de la Recherche et la Direction de le Générale L’Offre de Soins (Programme de Recherche Translationnelle en « Santé » ANR-13-prts-0010) pour les subventions. Les bailleurs de fonds n’avaient aucune influence dans la conception de l’étude, conduite et analyse ou dans la préparation de cet article.
Materials
| Sevoflurane | Baxter | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Isoflurane | Virbac | Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged | |
| Human Alveolar Epithelial cells | InScreenex | INS-CI-1015 | |
| huAEC Medium (ready-to-use) | InScreenex | INS-ME-1013-500ml | |
| Anesthetic machine circuit | Drager | Fabius | |
| Gas analyzer | Drageer | Vamos Plus | |
| Anesthetic gas filter | SedanaMedical | FlurAbsord | |
| Heated Humifier | Fisher&Paykel | MR850 | |
| Chamber | Curver | 00012-416-00 | |
| Gas chromatography coupled with mass detection | Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA | Trace 1310 with TSQ 8000evo | |
| Fused-silica column (30 m x 1.4 µm, 0.25 mm ID) | Restek, Lisses, France | Rxi-624Sil MS |
Referenzen
- Bellani, G., Laffey, J. G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. JAMA:T Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. The New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).
- Weiser, T. G., Regenbogen, S. E., et al. An estimation of the global volume of surgery: a modelling strategy based on available data. The Lancet. (9633), 139-144 (2008).
- Khuri, S. F., Henderson, W. G., et al. Determinants of long-term survival after major surgery and the adverse effect of postoperative complications. Annals of Surgery. 242 (3), 341-343 (2005).
- De Conno, E., Steurer, M. P., et al. Anesthetic-induced improvement of the inflammatory response to one-lung ventilation. Anesthesiology. 110 (6), 1316-1326 (2009).
- Fu, H., Sun, M., Miao, C. Effects of different concentrations of isoflurane pretreatment on respiratory mechanics, oxygenation and hemodynamics in LPS-induced acute respiratory distress syndrome model of juvenile piglets. Experimental Lung Research. 41 (8), 415-421 (2015).
- Reutershan, J., Chang, D., Hayes, J. K., Ley, K. Protective effects of isoflurane pretreatment in endotoxin-induced lung injury. Anesthesiology. (3), 511-517 (2006).
- Uhlig, C., Bluth, T., et al. Effects of Volatile Anesthetics on Mortality and Postoperative Pulmonary and Other Complications in Patients Undergoing Surgery: A Systematic Review and Meta-analysis. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 124 (6), 1230-1245 (2016).
- Li, Q. F., Zhu, Y. S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesthesia and Analgesia. (5), 1591-1597 (2009).
- Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., et al. Sevoflurane ameliorates gas exchange and attenuates lung damage in experimental lipopolysaccharide-induced lung injury. Anesthesiology. (6), 1238-1248 (2009).
- Englert, J. A., Macias, A. A., et al. Isoflurane Ameliorates Acute Lung Injury by Preserving Epithelial Tight Junction Integrity. Anesthesiology. (2), 377-388 (2015).
- Jabaudon, M., Boucher, P., et al. Sevoflurane for Sedation in ARDS: A Randomized Controlled Pilot Study. American Journal of Respiratory and Critical. , (2016).
- Blondonnet, R., Audard, J., et al. RAGE inhibition reduces acute lung injury in mice. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Receptor for Advanced Glycation End-Products Predicts Impaired Alveolar Fluid Clearance in Acute Respiratory Distress Syndrome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 192 (2), 191-199 (2015).
- Jabaudon, M., Blondonnet, R., et al. Soluble Forms and Ligands of the Receptor for Advanced Glycation End-Products in Patients with Acute Respiratory Distress Syndrome: An Observational Prospective Study. PloS One. 10 (8), e0135857 (2015).
- Kuehn, A., Kletting, S., et al. Human alveolar epithelial cells expressing tight junctions to model the air-blood barrier. ALTEX. 33 (3), 251-260 (2016).
- Yue, T., Roth Z’graggen, B., et al. Postconditioning with a volatile anaesthetic in alveolar epithelial cells in vitro. The European Respiratory Journal: Official Journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology. 31 (1), 118-125 (2008).
- Suter, D., Spahn, D. R., et al. The immunomodulatory effect of sevoflurane in endotoxin-injured alveolar epithelial cells. Anesthesia and Analgesia. (3), 638-645 (2007).
- Schläpfer, M., Leutert, A. C., Voigtsberger, S., Lachmann, R. A., Booy, C., Beck-Schimmer, B. Sevoflurane reduces severity of acute lung injury possibly by impairing formation of alveolar oedema. Clinical and Experimental Immunology. (1), 125-134 (2012).
- Nickalls, R. W. D., Mapleson, W. W. Age-related iso-MAC charts for isoflurane, sevoflurane and desflurane in man. British Journal of Anaesthesia. 91 (2), 170-174 (2003).
- Bourdeaux, D., Sautou-Miranda, V., et al. Simple assay of plasma sevoflurane and its metabolite hexafluoroisopropanol by headspace GC-MS. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 878 (1), 45-50 (2010).
- Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration. Anesthesiology. 26 (6), 756-763 (1965).
- Perbet, S., Fernandez-Canal, C., Pereira, B., Cardot, J. M., Bazin, J. E., Constantin, J. M. Evaluation of Richmond Agitation Sedation Scale According To Alveolar Concentration of Sevoflurane During a Sedation With Sevoflurane in Icu Patients. Intensive Care Medicine Experimental. 3 (Suppl 1), (2015).
- Goolaerts, A., Pellan-Randrianarison, N., et al. Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (11), L975-L985 (2014).
