Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica
Summary
Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare le strutture di canale ionico di cRIO-microscopia elettronica, compreso un sistema di baculovirus usato per esprimere in modo efficiente geni in cellule di mammiferi con minimo sforzo e tossicità, estrazione della proteina, purificazione, e controllo di qualità, preparazione del campione griglia e screening, nonché raccolta dati ed elaborazione.
Abstract
Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC) della sottofamiglia TRP canonica sono canali cationici non selettivi che svolgono un ruolo essenziale nell’omeostasi del calcio, voce negozio-funzionata specialmente del calcio, che è fondamentale per mantenere il corretto funzionamento del rilascio delle vescicole sinaptiche e vie di segnalazione intracellulare. Di conseguenza, canali TRPC sono stati implicati in una varietà di malattie umane, inclusi i disturbi cardiovascolari quali l’ipertrofia cardiaca, malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson e disturbi neurologici come atassia spinocerebellar. Canali TRPC rappresentano quindi un potenziale bersaglio farmacologico in malattie umane. Tuttavia, i meccanismi molecolari del gating in questi canali sono ancora poco chiari. La difficoltà nell’ottenere grandi quantità di proteina purificata, omogenea e stabile è stata un fattore limitante negli studi di determinazione di struttura, particolarmente per le proteine di membrana dei mammiferi quali i canali ionici TRPC. Qui, presentiamo un protocollo per l’espressione su larga scala di proteine di membrana del canale dello ione dei mammiferi utilizzando un sistema di trasferimento del gene di baculovirus modificate e la purificazione di queste proteine di affinità e la cromatografia di esclusione dimensionale. Presentiamo inoltre un protocollo per raccogliere immagini di microscopia di singola particella cryo-elettrone dalla proteina purificata e utilizzare queste immagini per determinare la struttura della proteina. Determinazione della struttura è un metodo potente per la comprensione dei meccanismi di gating e funzione di canali ionici.
Introduction
Calcio è coinvolto nei processi più cellulari tra cui segnalazione cascades, controllo trascrizione, rilascio di neurotrasmettitori e ormoni molecola sintesi1,2,3. Il mantenimento omeostatico di calcio libero citosolico è cruciale per la salute e la funzione delle cellule. Uno dei principali meccanismi dell’omeostasi intracellulare del calcio è calcio store-operati voce (SOCE), un processo in cui lo svuotamento di calcio memorizzati nei trigger del reticolo endoplasmatico (ER) l’apertura dei canali ionici sulla membrana plasmatica per facilitare la rifornimento di calcio di ER, che può quindi essere utilizzato in ulteriore segnalazione4,5,6. Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC), che sono canali calcio-permeabile della superfamiglia di TRP, sono stati identificati come un partecipante importante SOCE7,8,9 .
Tra i sette membri della famiglia di TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formano un sottogruppo di omologo, e sono unici nella capacità di essere attivato dal lipido messaggero secondario diacilglicerolo (DAG), un prodotto di degradazione del lipido di segnalazione fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2)10,11. TRPC3 è altamente espressa nel muscolo liscio e nelle regioni cerebrali e cerebellari del cervello, in cui svolge ruoli essenziali nella segnalazione del calcio che hanno un impatto neurotrasmissione e neurogenesi12,13. Disfunzione di TRPC3 è stata collegata a disturbi del sistema nervoso centrale, disturbi cardiovascolari e alcuni tipi di cancro come adenocarcinoma ovarico14,15,16. Pertanto, TRPC3 tiene la promessa come una destinazione farmaceutica per il trattamento di queste malattie. Lo sviluppo di farmaci specificamente mirati che agiscono sul TRPC3 è stato limitato da una mancanza di comprensione dei suoi meccanismi molecolari di attivazione, tra cui lipidica associazione siti17,18. Abbiamo segnalato la prima struttura di atomico-risoluzione del canale umano di TRPC3 (hTRPC3) e suoi siti di legame di lipido due in uno stato chiuso, fornendo importanti intuizioni questi meccanismi19.
Il fattore chiave per determinare la struttura di una proteina di membrana ad alta risoluzione è quello di ottenere proteine di alta qualità. La proiezione corrispondente espressione e purificazione condizioni necessarie per ottenere proteine di alta qualità può essere uno sforzo lungo e oneroso. Qui presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio come identificare le condizioni ottimali per l’espressione e purificazione di hTRPC3, che si è comportato male in nostro screening iniziale. Vi presentiamo alcuni punti chiave su come risolvere i problemi e ottimizzare il comportamento della proteina, che pongono una solida base per il nostro cryo-elettrone studi di microscopia (cryo-EM). Usiamo un baculovirus modificate generando vettoriale (pEG), sviluppato da Gouaux e colleghi, che è ottimizzato per lo screening di analisi e generazione efficiente di baculovirus in cellule di mammifero20. Questo metodo di espressione è appropriato per rapido ed economico iperespressione delle proteine nella membrana delle cellule dei mammiferi. Uniamo l’utilizzo di questo vettore con una rilevazione della fluorescenza esclusione basata su cromatografia (FSEC) prescreening metodo21. Questo metodo utilizza un tag di proteina fluorescente verde (GFP) fuso al costrutto di interesse e migliora la visualizzazione della proteina dell’obiettivo in piccole, cellule intere campioni solubilizzati. Questo permette per lo screening della stabilità proteica in presenza di diversi detergenti e additivi, con mutazioni di thermostabilizing e permette l’uso di un piccolo numero di cellule dalla trasfezione transiente in piccola scala. In questo modo, una moltitudine di condizioni può essere rapidamente proiettata prima di passare ad una purificazione di proteine su larga scala. A seguito di espressione, lo screening e la purificazione, presentiamo un protocollo per ottenere ed elaborare immagini da cryo-EM per generare una de novo determinazione strutturale della proteina. Noi crediamo che gli approcci descritti qui servirà come un protocollo generalizzabile per studi strutturali di recettori canale TRP e altre proteine di membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Determinazione strutturale delle proteine da cryo-EM ha rivoluzionato il campo della biologia strutturale negli ultimi anni, grazie allo sviluppo delle nuove telecamere e algoritmi che velocizza notevolmente la determinazione della struttura delle proteine che non prontamente cristallizzarsi, in particolare proteine di membrana. Nonostante tutti i recenti progressi nella tecnica di cryo-EM, la preparazione delle proteine purificate in qualità e quantità sufficiente per facilitare ad alta-qualità delle immagini spesso …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringraziano G. Zhao e X. Meng per il supporto con raccolta di dati presso il David Van Andel Advanced Cryo-Electron microscopia Suite. Apprezziamo il team VARI High-Performance Computing per supporto computazionale. Noi diamo la nostra gratitudine a N. Clemente, D. debiti, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z per i commenti che ha notevolmente migliorato questo manoscritto. Si ringrazia D. Nadziejka per supporto editoriale per questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da interno VARI finanziamenti.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
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