Mechanische micronisatie voor Lipoaspirates voor regeneratieve therapie

Summary

Hier presenteren we een protocol om te verkrijgen stromale vasculaire breuk van adipeus weefsel door middel van een reeks van mechanische processen, waaronder membraanemulsificatie en meerdere centrifugations.

Abstract

Stromale vasculaire breuk (SVF) is uitgegroeid tot een regeneratieve instrument voor verschillende ziekten; wetgeving regelt echter strikt de klinische toepassing van cel-producten met behulp van collagenase. Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een injecteerbare mengsel van SVF cellen en inheemse extracellulaire matrix uit vetweefsel langs zuiver mechanische weg. Lipoaspirates zijn een centrifuge gestoken en gesponnen op 1.200 x g gedurende 3 minuten. De middenlaag wordt verzameld en gescheiden in twee lagen (hoge dichtheid onderaan) en lage dichtheid vet op de top. De bovenste laag is direct geëmulgeerd door intersyringe verschuift, met een snelheid van 20 mL/s voor 6 x tot 8 x. Het geëmulgeerd vet wordt gecentrifugeerd bij 2.000 x g gedurende 3 minuten, en de kleverige substantie onder de olie laag is verzameld en gedefinieerd als de extracellulaire matrix (ECM) / SVF-gel. De olie in de bovenste laag wordt verzameld. Ongeveer 5 mL olie is toegevoegd aan 15 mL high-density vet en geëmulgeerde door intersyringe verschuift, met een snelheid van 20 mL/s voor 6 x tot 8 x. Het geëmulgeerd vet wordt gecentrifugeerd bij 2.000 x g gedurende 3 minuten, en de kleverige substantie is ook ECM/SVF-gel. Na de transplantatie van de ECM/SVF-gel in naakt muizen, is de prothese geoogst en beoordeeld door histologische onderzoek. Het resultaat geeft aan dat dit product heeft het potentieel om te regenereren in normale adipeus weefsel. Deze procedure is een eenvoudige, effectieve mechanische dissociatie te condenseren van de cellen van de FØROYA ingebed in hun natuurlijke ondersteunende ECM voor regeneratieve doeleinden.

Introduction

Stamcel-therapieën bieden een paradigmaverschuiving voor weefselherstel en regeneratie zodat zij een alternatieve therapeutische regime voor verschillende ziekten^{1 bieden kunnen}. Stamcellen (b.v., geïnduceerde pluripotente stamcellen en embryonale stamcellen) hebben een groot therapeutisch potentieel maar zijn beperkt als gevolg van cel regelgeving en ethische overwegingen. Adipeus afkomstige mesenchymale stromale/stamcellen (ASC’s) zijn eenvoudig te verkrijgen van lipoaspirates en niet onderworpen aan dezelfde beperkingen; het is dus een ideale celtype voor praktische regeneratieve geneeskunde²geworden. Bovendien, ze zijn nonimmunogenic en hebben overvloedige hulpbronnen van autologe vet³.

ASC’s zijn op dit moment verkregen voornamelijk door collagenase-gemedieerde vertering van het vetweefsel. De stromale vasculaire breuk (SVF) van vetweefsel bevat ASC’s, Endotheel progenitor cel, pericytes en immuuncellen. Hoewel het verkrijgen van een hoge dichtheid van SVF/ASC’s enzymatisch bleek te hebben gunstige effecten, regelt de wetgeving in verschillende landen strikt de klinische toepassing van cel-gebaseerde producten met behulp van collagenase⁴. Het vetweefsel met collagenase voor 30 min tot 1 h te verkrijgen van SVF cellen verteren verhoogt het risico van zowel exogene materiaal bij de voorbereiding en de biologische verontreiniging. De aanhangend cultuur en de zuivering van ASC’s, die dagen tot weken duurt, vereisen specifieke laboratoriumapparatuur. Bovendien, in de meeste studies, SVF cellen en ASC’s worden gebruikt in suspensie. Zonder de bescherming van de extracellulaire matrix (ECM) of een andere vervoerder, vrije cellen zijn kwetsbaar, veroorzaken een slechte cel bewaren na injectie en compromis de therapeutische resultaat⁵. Al deze redenen beperken de verdere toepassing van stamcel therapie.

Voor het verkrijgen van ASC’s uit vetweefsel zonder collagenase-gemedieerde spijsvertering, verschillende mechanische processing procedures, met inbegrip van centrifugeren, mechanische hakken, versnipperen, pureren en hakken, geweest ontwikkelde^{6,7 , 8 , 9}. deze methoden worden verondersteld te condenseren weefsel en ASC’s door mechanisch verstoren volwassen adipocytes en hun olie-bevattende blaasjes. Deze preparaten, hoge concentraties van ASC’s, toonde bovendien aanzienlijk therapeutisch potentieel als regeneratieve geneeskunde in dierlijke^{8,9,10 modellen}.

In 2013 introduceerde Tonnard et al. de nanofat enten techniek, waarbij de overlegging van de geëmulgeerd lipoaspirates van intersyringe verwerking van¹¹. De shearing kracht gemaakt door de intersyringe verschuiven kan selectief volwassen adipocytes breken. Op basis van hun bevindingen, ontwikkelde we een zuiver mechanisch verwerkingsmethode die verwijdert de meeste van de lipide en vloeistof in de lipoaspirates, verlaten alleen SVF cellen en gespreide ECM, oftewel ECM/SVF-gel¹². Hierin beschrijven we de details van de mechanische proces van mens-afgeleide adipeus weefsel te produceren van de ECM/SVF-gel.

Protocol

Dit onderzoek werd goedgekeurd door de ethische Review Board in Nanfang ziekenhuis, Guangzhou, China. Adipeus weefsel werd bijeengezocht uit gezonde donoren die gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming deel te nemen aan de studie. Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Nanfang ziekenhuis institutionele Animal Care en gebruik Comité en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Health and Medical Research Council (China). 1. ECM/SVF-gel voorbereiding Oogst de vet.<ol…

Representative Results

Na het verwerken van het vet van de Coleman op ECM/SVF-gel, neemt het volume van de weggegooide olie 80% van het uiteindelijke volume, en slechts 20% van het vetweefsel onder de olie laag bewaard wordt beschouwd als ECM/SVF-gel(Figuur 1). ECM/SVF-gel heeft een gladde vloeistof-achtige textuur die het mogelijk maakt om te gaan via een fijne naald van 27 G; echter, Coleman vet bestaat uit een integraal obesitas structuur met grote vezels en kan…

Discussion

Stamcel-based regeneratieve therapie blijkt een grote potentiële voordelen in verschillende ziekten. ASC’s zijn uitstekende therapeutische kandidaten omdat ze gemakkelijk te verkrijgen en de capaciteit voor weefselherstel en de regeneratie van nieuwe weefsels¹⁵. Er zijn echter beperkingen aan het uitbreiden van de klinische toepassing ervan, omdat het vereist gecompliceerde procedures om cellen en collagenase voor de verwerking van⁶te isoleren. Het is dus essentieel voor h…

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus