Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin
Summary
Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.
Abstract
Sinir kök hücreleri (NSCs) multipotent ve merkezi sinir sistemi (MSS) üç büyük hücre tür çıkmasına neden olabilir. Vitro kültür ve NSCs genişlemesi hücrelerin nöronlar fonksiyonu çalışmaya nörologlar için ve onların etkileşim ile birlikte Gliyal hücreler uygun bir kaynak sağlar. Yetişkin veya embriyo memeli beyin sinir kök hücreleri yalıtım bildirilen bazı teknikler vardır. NSCs embriyonik CNS farklı bölgelerinden izole mikrocerrahi işlem sırasında canlı ve Genişletilebilir kök hücrelerin en yüksek oranı elde etmek için beyin hücrelerine zarar azaltmak çok önemlidir. Stres azaltma sırasında yalıtım fare embriyo beyin bu hücre için olası bir teknik cerrahi zaman azalma var. Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bu hücreler hızlı yalıtım için gelişmiş bir tekniği göstermek. Cerrahi işlemler E13 fare embriyo gelen beyin kafatasından mikrodiseksiyon ganglionic Hazretleri hasat izole beyin açılan bir bükülmüş iğne ucu ile embriyo ön Fontanel kesme rahim, hasat dahil, ayrılma NSC orta bir tek hücre süspansiyon kazanmak için hasat dokusunda ve sonunda kaplama hücre süspansiyon kültür neurospheres oluşturmak için.
Introduction
Sinir kök hücreleri (NSCs) Yetişkin ve embriyo beyin farklı bölgelerinde bulunan ve farklı nöronlar ve gliyal hücreye1oluşturmak için bir eğilim vardır. 2 yetişkin memeli beyin subventricular bölgeler ve embriyo beyinde ganglionic Hazretleri NSC zengin bölgeleri3olabilir. Gelişmekte olan beyin, ganglionic itibar kortikal interneurons ve özellikle GABAergic interneurons3çoğunu sağlar. Ayrıca daha az invaziv yöntem vardır embriyonik kök hücrelerden (ESCs) sinir kök hücre üretimi için veya hayvan talebi azaltmak indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) kullanın. NSCs ESCs veya iPSCs üreten olası4,5olması rağmen bazı avantajları ve dezavantajları sinir kök hücreleri yalıtım için yetişkin veya embriyo beyin6,7göre vardır, 8. ESCs ve iPSCs nöronal fenotipleri doğru farklılaşma inducing iletişim kurallarını her zaman zaman ve maliyet tüketen ve başarı (% 70-80 Nestin pozitif hücrelerinin)5 oranı düşük doğrudan NSCs izolasyonu hayvan beyin () ile karşılaştırıldığında fazla %99 Nestin pozitif hücrelerinin)9. Ayrıca, kök hücrelerin genetik onların istikrar ve farklılaşma eğilimi sonra çeşitli pasajlar10,11kaybetmek. NSCs içine somatik hücre doğrudan dönüşüm hakkında diğer yeni raporlar olsa bile, bu hücrelerin genetik mühendisliğiyle ve her laboratuvar12‘ kolayca erişilebilir değildir. Bu nedenle, hala izolasyon-in hayvan beyin sinir kök hücreleri için büyük bir talep var; cerrahi teknikler geliştirerek hayvan kullanımı miktarını azaltmak mümkündür. Cerrahi süresini azaltmak ve teknikleri geliştirmek, hücreler zarar uzak tutmak ve NSCs en yüksek oranı her hayvandan elde etmek mümkündür.
Burada, fare E13 embriyo beyinden yalıtım nöral kök hücrelerin teknik bir Basitleştirilmiş ve tekrarlanabilir tanıtmak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nöral kök hücrelerin uygun bir kaynak kullanarak nörologlar için çok önemlidir. Sinir kök hücreleri embriyo beyin farklı bölgelerinden hasat edilecek ve nöronlar ve Gliyal hücreler belirli türleri oluşturabilir. İndüksiyon farklılaşma nöral kök hücrelerin olgun nöronlar ve Gliyal hücreler oluşturmak için onları ikna etmek için birkaç yöntem vardır. Belirli koşullar ve trofik faktör alayı altında onlar nöronlar14, oligodendrocytes15,<…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Royan Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
Referenzen
- Navarro Quiroz, E., et al. Cell Signaling in Neuronal Stem Cells. Cells. 7 (7), (2018).
- Choi, C. I., et al. The Thrombin Receptor Restricts Subventricular Zone Neural Stem Cell Expansion and Differentiation. Scientific Reports. 8 (1), 9360 (2018).
- Li, H., et al. Isolation of a novel rat neural progenitor clone that expresses Dlx family transcription factors and gives rise to functional GABAergic neurons in culture. Developmental Neurobiology. 72 (6), 805-820 (2012).
- Liu, Y., et al. Derivation of phenotypically diverse neural culture from hESC by combining adherent and dissociation methods. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Dhara, S. K., et al. Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures. Differentiation. 76 (5), 454-464 (2008).
- Aligholi, H., Hassanzadeh, G., Gorji, A., Azari, H. A Novel Biopsy Method for Isolating Neural Stem Cells from the Subventricular Zone of the Adult Rat Brain for Autologous Transplantation in CNS Injuries. Methods in Molecular Biology. 1462, 711-731 (2016).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).
- Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2010).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature Protocols. 7 (2012), (2005).
- Liu, P., et al. Passage Number is a Major Contributor to Genomic Structural Variations in Mouse iPSCs. Stem Cells and Development. 32 (10), 2657-2667 (2014).
- Diaferia, G. R., et al. Systematic Chromosomal Analysis of Cultured Mouse Neural Stem Cell Lines. Stem Cells and Development. 20 (8), 1411-1423 (2011).
- Hemmer, K., et al. Induced Neural Stem Cells Achieve Long-Term Survival and Functional Integration in the Adult Mouse Brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Zhang, Z., Wang, Z., Rui, W., Wu, S. Magnesium lithospermate B promotes proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro and enhances neurogenesis in vivo. Tissue and Cell. 53, 8-14 (2018).
- Zilkha-Falb, R., Gurevich, M., Hanael, E., Achiron, A. Prickle1 as positive regulator of oligodendrocyte differentiation. Neurowissenschaften. 364, 107-121 (2017).
- Wang, L., et al. Oligodendrocyte differentiation from human neural stem cells: A novel role for c-Src. Neurochemistry International. 120, 21-32 (2018).
- Palanisamy, A., et al. Oxytocin alters cell fate selection of rat neural progenitor cells in vitro. PLoS ONE. 13 (1), e0191160 (2018).
- Llewellyn-Smith, I. J., Basbaum, A. I., Braz, J. M. Long-term, dynamic synaptic reorganization after GABAergic precursor cell transplantation into adult mouse spinal cord. Journal of Comparative Neurology. 526 (3), 480-495 (2018).
- Precious, S. V., et al. FoxP1 marks medium spiny neurons from precursors to maturity and is required for their differentiation. Experimental Neurology. 282, 9-18 (2016).
