Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas
Summary
Neuroesferas crecidos como culturas 3D constituyen una poderosa herramienta para estudiar la biología del glioma. Aquí presentamos un protocolo para realizar inmunohistoquímica manteniendo la estructura 3D de glioma neuroesferas a través de la inclusión en parafina. Este método permite la caracterización de propiedades de desarrolló de glioma como troncalidad y diferenciación de los nervios.
Abstract
Análisis de expresión de proteínas en glioma es relevante por varios aspectos en el estudio de su patología. Se han descrito numerosas proteínas como biomarcadores con aplicaciones en diagnosis, pronóstico, clasificación, estado de progresión del tumor y estado de diferenciación celular. Estos análisis de biomarcadores también son útiles para caracterizar el tumor neuroesferas (NS) generados a partir de pacientes de glioma y modelos de glioma. Tumor NS proporcionan un modelo valioso en vitro para evaluar diversas características de tumor de que se derivan y pueden más exactamente espejo glioma biología. Aquí describimos un método detallado para analizar biomarcadores en tumor NS mediante inmunohistoquímica (IHQ) en tumor de parafina-encajado NS.
Introduction
Los gliomas son los tumores sólidos primarios del sistema nervioso central clasificados por sus características fenotípicas y genotípicas según la Organización Mundial de la salud1. Esta clasificación incorpora la presencia o ausencia de mutaciones del conductor, que representan una atractiva fuente de biomarcadores2. Biomarcadores son características biológicas que pueden ser medidas y evaluadas para indicar procesos normales y patológicos, así como la respuesta farmacológica a una intervención terapéutica3. Biomarcadores se pueden detectar en el tejido del tumor y las células derivadas de glioma, lo que permite su caracterización biológica en diferentes aspectos. Algunos ejemplos de biomarcadores de glioma mutado Isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1), una enzima del mutante de gliomas de bajo grado asociados a mejor pronóstico4. IDH1 transformada se expresa con frecuencia en combinación con el síndrome de la alfa-talasemia/retraso mental X-ligado (ATRX) y TP53-hacer inactivo mutaciones, definiendo un glioma específico subtipo4,5. ATRX inactivar mutaciones también se producen en el 44% de gliomas de alto grado pediátrica2,6 y han sido asociadas con tumores agresivos e inestabilidad genómica6,7. Además, los gliomas del pontine intrínsecos difusos pediátricos (DIPG) se distinguen en subgrupos según la presencia o ausencia de una mutación de K27M en el gene de histona H3 H3F3A, o en el gen HIST1H3B/C1,6. Por lo tanto, la introducción de caracterización molecular permite la subdivisión, estudio y tratamiento de los gliomas como entidades separadas, que se permite el desarrollo de más objetivo terapias para cada subtipo. Además, puede utilizarse el análisis de biomarcadores para evaluar diferentes procesos biológicos tales como apoptosis8autofagia9, de la progresión del ciclo celular10, proliferación de la célula11y diferenciación celular12 .
Modelos animales modificados genéticamente que albergan las lesiones genéticas presentes en los cánceres humanos son críticos para el estudio de la señalización de las vías que median la progresión de la enfermedad. Nuestro laboratorio ha implementado el uso del sistema transposasa belleza durmiente (SB) para el desarrollo de modelos de ratón modificados genéticamente de glioma abrigar mutaciones específicas que recapitulan glioma humano subtipos13,14. Estos modelos de ratón modificados genéticamente se utilizan para generar tumor derivado NS, que permiten estudios en vitro en un sistema 3D, espejadas características presentan en los tumores in situ15. Además, el trasplante de orthotopical de NS en ratones puede generar tumores secundarios que retienen características del tumor primario y mímico las características histopatológicas, genómicas y fenotípicas del tumor primario correspondiente15.
En cultivo libre de suero, las células del tumor cerebral con propiedades de células madre pueden ser enriquecidas y en presencia de factores de crecimiento epidérmicos (EGF) y factores de crecimiento de fibroblasto (FGF), pueden cultivarse como solo colonias derivadas de células como las culturas NS. En este sistema de cultivo selectivo, mayoría diferenciadoras o diferenciadas de las células mueren rápidamente, mientras que células madre se dividen y forman los grupos celulares. Esto permite la generación de una cultura de NS que mantiene glioma tumor características16,17,18. Glioma NS puede utilizarse para evaluar varios aspectos de la biología del tumor, incluyendo el análisis de biomarcadores que tienen aplicaciones en diagnosis, pronóstico, clasificación, estado de progresión del tumor y estado de diferenciación celular. Aquí detallamos un protocolo generar glioma NS e integrar las culturas 3D en parafina para ser utilizado para la tinción de IHC. Una ventaja de fijación y embebido glioma NS es que la morfología del NS se mantiene mejor en comparación con el cytospin convencional método19, en que glioma NS son sometido a manipulación estresante para disociación celular y ser aplanado. Además, incrustar apaga cualquier expresión endógena fluoróforo de tumor genéticamente NS, lo que permite la tinción a través de los espectros fluorescentes. El objetivo general de este método es preservar la estructura 3D de las células del glioma a través de un proceso de inclusión de parafina y caracterización de neuroesferas de glioma usando immunohistochemistry.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo detallamos un método reproducible y versátil para realizar inmunohistoquímica en parafina-encajado glioma NS, que mantienen la característica estructura 3D de las células del tumor en el cerebro in situ. Esta técnica posee las siguientes ventajas sobre usar células plateadas en superficies de plástico o vidrio: i) preservación de la estructura 3D del NS; II) evitando de la tensión de disociación celular antes del análisis de expresión de la proteína; III) amortiguamiento de cualqu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos de salud nacional Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y derrame cerebral (NINDS/NIH) subvenciones R37-NS094804, NS074387 R01, R21-NS091555 a M.G.C.; NIH/NINDS becas R01-NS076991, NS082311 R01 y R01-NS096756 de P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; el Departamento de Neurocirugía; Corazones felices de Leah a M.G.C. y P.R.L.; y RNA biomedicina Grant F046166 a M.G.C. F.M.M. es apoyado por un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. fue apoyado por Fulbright Argentina Ministerio de deportes y educación beca.
Materials
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
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