Merkel cel Polyomavirus infectie en detectie
Summary
Hier presenteren we een protocol om te infecteren primaire menselijke dermale fibroblast met MCPyV. Het protocol bevat Isolatievan dermale fibroblasten, voorbereiding van MCPyV virionen, virusbesmetting, immunofluorescentie kleuring en fluorescentie in situ hybridisatie. Dit protocol kan worden uitgebreid voor het karakteriseren van MCPyV-gastheer interacties en het ontdekken van andere celtypes ze door MCPyV.
Abstract
Merkel cel polyomavirus (MCPyV) infectie kan leiden tot Merkel cel carcinoom (MCC), een zeer agressieve vorm van huidkanker. Mechanistisch onderzoek te onderzoeken volledig MCPyV moleculaire biologie en oncogene mechanismen hebben belemmerd door een gebrek aan voldoende cel cultuur modellen. Hier beschrijven we een aantal protocollen voor het uitvoeren en het opsporen van MCPyV infectie van primaire menselijke huidcellen. De protocollen beschrijven het isolement van menselijke dermale fibroblasten, voorbereiding van recombinante MCPyV virionen, en detectie van virusinfectie door zowel immunefluorescentie (IF) kleuring en in situ DNA-hybridisatie kettingreactie (HCR), dat een uiterst gevoelige is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) benadering. De protocollen hierin kunnen worden aangepast door interesse onderzoekers om andere soorten cellen of cellijnen die ondersteuning bieden voor MCPyV infectie te identificeren. De beschreven aanpak van de vis kan ook worden aangepast voor het opsporen van lage niveaus van virale Ani aanwezig in de besmette menselijke huid.
Introduction
Merkel cel polyomavirus (MCPyV) is een kleine, double-stranded DNA-virus dat is gekoppeld aan een zeldzame maar agressief huidkanker, Merkel cel carcinoom (MCC)1,2. Het sterftecijfer van MCC, ongeveer 33% hoger dan die van melanoom3,4. MCPyV heeft een circulaire genoom van ~ 5 kb1,5 doorsneden door een niet-coderende regelgevende regio (NCRR) in het vroeg en laat codering gebieden1. De NCRR bevat de virale oorsprong van replicatie (Ori) en bidirectionele promotoren voor virale transcriptie6,7. De vroege regio codeert tumor antigeen proteïnen genaamd grote T (LT), kleine T (sT), 57kT, alternatieve LT ORF (ALTO), evenals een autoregulatory miRNA1,8,9,10. De late regio codeert de Eiwitmantel eiwitten VP1 en VP211,12,13. LT sT de best bestudeerde MCPyV eiwitten en zijn ter ondersteuning van de virale DNA replicatie en MCPyV-geïnduceerde tumorvorming5is gebleken. Klonen integratie van MCPyV DNA in het genoom van de host, die tot 80% van MCCs oedeem is waargenomen, is waarschijnlijk een oorzakelijke factor voor virus-positieve tumor ontwikkeling14,15.
De incidentie van MCC heeft verdrievoudigd in de afgelopen twintig jaar16. Asymptomatische infectie van de MCPyV is ook wijdverbreid in de algemene bevolking17,18,19. Met het toenemende aantal MCC diagnoses en de hoge prevalentie van MCPyV infectie is er behoefte aan een betere ons begrip van het virus en zijn potentieel oncogene. Toch blijven veel aspecten van MCPyV biologie en oncogene mechanismen slecht begrepen20. Dit is vooral omdat MCPyV gerepliceerd slecht in gevestigde cel lijnen11,12,21,22,23 en, tot voor kort huidcellen beeldschermresolutie ondersteunen MCPyV infectie had niet ontdekt22. Mechanistisch onderzoek te onderzoeken volledig MCPyV en zijn interactie met de gastheer cellen hebben belemmerd door een gebrek aan celcultuur voor vermeerdering van het virus-5.
We ontdekten dat de primaire menselijke dermale fibroblasten (HDFs) geïsoleerd van neonatale menselijke voorhuid ondersteuning robuuste MCPyV infectie beide in vitro en ex vivo24. Uit deze studie vastgesteld we het eerste model van het infectie van de cultuur van de cel voor MCPyV24. Voortbouwend op dit modelsysteem, toonden we dat de inductie van matrix metalloproteinase (MMP) genen door de WNT/β-catenine signalering traject en andere factoren die de groei MCPyV infectie stimuleert. Bovendien, we vonden dat de FDA-goedgekeurde MEK antagonist trametinib effectief MCPyV infectie5,25 remt. Uit deze studies vastgesteld wij een verzameling protocollen voor het isoleren van de menselijke dermale fibroblasten24,25, voorbereiding MCPyV virionen11,12, MCPyV infectie wilt uitvoeren op menselijke dermale fibroblasten 24 , 25 en detectie MCPyV eiwitten door als kleuring26. Bovendien, aangepast we de in situ DNA hybridisatie kettingreactie (HCR) technologie27 voor de ontwikkeling van een hooggevoelige vis techniek (HCR-DNA vis) voor het opsporen van MCPyV DNA in besmette menselijke huidcellen. Deze nieuwe methoden zijn nuttig voor het bestuderen van de besmettelijke cyclus van MCPyV, alsmede de cellulaire respons op MCPyV infectie. De natuurlijke gastheer reservoir cellen die MCPyV infecties te handhaven en de cellen die aanleiding tot MCC tumoren geven blijven onbekend. De technieken die we in dit manuscript beschrijven kon worden toegepast om te onderzoeken van de verschillende soorten menselijke cellen zowel de cellen van het reservoir worden geïdentificeerd en de oorsprong van MCC tumoren. Onze gevestigde methoden, zoals het Hoge Commissariaat voor vluchtelingen-DNA vis, kunnen ook worden gebruikt in de opsporing van andere DNA tumor virussen en de karakterisatie van gastheer cel interacties.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methoden die hierboven beschreven, met inbegrip van isolatie van dermale fibroblasten van menselijke huidweefsel, voorbereiding van recombinante MCPyV virionen, infectie van gekweekte cellen, immunefluorescentie kleuring en een gevoelige vis methode aangepast van HCR technologie, die onderzoekers te analyseren MCPyV infectie27in staat moeten stellen. Een van de meest kritische stappen tot de verwezenlijking van de in vitro MCPyV-infectie is de productie van hoge-titer virion preparaten. Met beh…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Instituut) en Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) voor het verstrekken van reagentia en technische ondersteuning. Wij danken ook de leden van onze laboratoria voor nuttige discussie. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies (R01CA187718, R01CA148768 en R01CA142723), de NCI Cancer Center ondersteuning subsidie (NCI P30 CA016520) en de Penn BVERRE award (P30 AI 045008).
Materials
| Fetal calf serum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamine |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG-200 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Store at -80 degree celsius |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Store at -80 degree celsius |
| Collagenase type IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Protect from light |
| DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Protect from light |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Protect from light |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Protect from light |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lot # B2717 |
| MCV VP1 rabbit | Rabbit polyclonal serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant | Corning | 354060 | Store at -80 degree celsius |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Probe hybridization buffer | Molecular technologies | ||
| Probe wash buffer | Molecular technologies | ||
| Amplification buffer | Molecular technologies | ||
| Alexa 594-labeled hairpins | Molecular technologies | B4 | Protect from light |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blue miniprep spin column | Qiagen | 27104 | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| T4 ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Referenzen
- Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
- Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
- Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
- Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
- Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
- Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
- Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
- Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
- Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
- Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
- Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
- Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
- Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
- Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
- Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
- Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
- Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
- Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
- Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
- Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
- Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
- Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
- Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
- Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
- . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)
