Cel fractionering van U937 cellen in het ontbreken van snelle centrifugeren
Summary
Hier presenteren we een protocol om te isoleren van het plasmamembraan, cytoplasma en mitochondria van U937 cellen zonder het gebruik van high-speed centrifugeren. Deze techniek kan worden gebruikt voor het zuiveren van subcellular breuken voor latere onderzoek van eiwit lokalisatie via immunoblotting.
Abstract
In dit protocol detail wij een werkwijze te halen subcellular breuken van U937 cellen zonder het gebruik van ultracentrifugatie of willekeurige detergentia. Deze methode maakt gebruik van hypotone buffers, digitonin, mechanische lysis en differentiële centrifugeren te isoleren van het cytoplasma, de mitochondriën en het plasma membraan. Het proces kan worden aangepast om te voldoen aan de behoeften van de onderzoekers, is goedkoop en eenvoudig. Deze methode zal toelaten onderzoekers om te bepalen van de lokalisatie van de eiwitten in cellen zonder gespecialiseerde centrifuges en zonder het gebruik van commerciële kits, die beide onbetaalbaar worden kunnen. We hebben met succes gebruikt deze methode om te scheiden cytosolische, plasmamembraan en eiwitten mitochondriaal in de menselijke monocyt cellijn U937.
Introduction
Betrouwbare identificatie van eiwit lokalisatie is vaak noodzakelijk, bij het onderzoek van moleculaire pathways in eukaryote cellen. Methoden om te verkrijgen subcellular breuken worden gebruikt door onderzoekers nauwer onderzoeken cellulaire componenten van belang.
Het merendeel van de bestaande cel fractionering methoden in het algemeen vallen in twee brede categorieën, wasmiddel gebaseerde,1,2 en ultracentrifugatie gebaseerde,3,4,5, die kunnen worden onderscheiden zich door snelheid, precisie en kosten. Wasmiddel gebaseerde protocollen, is afhankelijk van het gebruik van buffers met toenemende wasmiddel kracht om te solubilize van de verschillende onderdelen van de cel. Dit kan is een snelle en handige methode voor het verwerken van monsters en kosteneffectief als het aantal en de grootte van de monsters klein zijn. Wasmiddel-gebaseerde kits kunnen worden gekocht om te isoleren cytoplasmatische membraan/organel (gemengde fractie) en nucleaire breuken uit cellen. Echter, verschillende nadelen verbonden aan deze kits beperken hun nut voor de onderzoekers. Ze zijn ontworpen om te isoleren gemakkelijk een of twee onderdelen van de cel, maar zijn niet in staat om alle breuken uit een steekproef gelijktijdig te isoleren. Het gebruik van detergentia betekent dat het plasmamembraan en membraan-omsloten organellen even zal worden solubilized en dus niet van elkaar worden gescheiden. Een extra complicatie ontstaat uit de eigen componenten in deze kits die verhindert dat onderzoekers wijziging van de voorwaarden voor specifieke toepassingen. Tot slot, ze zijn beperkt in aantal toepassingen en kunnen worden onbetaalbaar voor grotere schaal experimenten. Non-wasmiddel gebaseerde kits bestaan voor de isolatie van mitochondriën, echter ze zijn niet ontworpen om te isoleren plasmamembraan en de opbrengst van het monster is aanzienlijk minder dan die van dichtheid centrifugeren op basis van isolatie protocollen6,7 .
Methoden die gebruikmaken van ultracentrifugatie voor breuken zijn meer tijdrovend, maar vaak resulteren in zuiverder breuken dan wasmiddel-gebaseerde kits. Zij worden door een niet-wasmiddel-methode die gevolgd wordt door een scheiding van cellulaire componenten via differentiële lysed moeten plasma membranen van cellen isoleren zonder eerste solubilizing hen (wat resulteert in verontreiniging met membraan organellen) centrifugeren — met plasmamembraan isolatie vereisen snelheden van 100.000 × g te bereiken. In veel gevallen moet de differentiële centrifugeren worden gevolgd door isopycnic dichtheid kleurovergang centrifugeren voor verdere scheiding van cellulaire breuken of verwijdering van verontreinigende stoffen. Terwijl deze methoden grondige en aanpasbaar zijn, zijn nadelen kosten, tijd consumptie en de noodzaak van een ultracentrifuge voor scheiding van breuken en verdere zuivering via dichtheid kleurovergang centrifugeren. Meeste high-speed centrifuges zijn tegen een kostprijs die is onbetaalbaar voor individuele onderzoekers en zijn vaak gedeeld, core apparatuur op academische instellingen. Zo wordt de ultracentrifuge beschikbaarheid onbetaalbaar is in deze situaties.
In dit protocol fractionering tonen wij de isolatie van subcellular breuken zonder het gebruik van solubilizing van detergentia en zonder hoge snelheid centrifugeren. Deze methode zal toelaten onderzoekers te isoleren van het plasmamembraan, de mitochondriën en de cytoplasmatische onderdelen van een eukaryote cel met minimale besmetting tussen breuken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ontwikkeling van dit protocol is ontstaan uit een onvermogen om te scheiden van mitochondriale en membraan monsters, met behulp van commercieel beschikbare kits, p.a. van eiwit lokalisatie tijdens necroptosis14. De primaire beperkingen van premade kits zijn hun onvermogen om te worden aangepast aan de behoeften van individuele onderzoekers, hun kosten per monster en beperkt aantal monsters kan worden verwerkt. De methode die hier gepresenteerd kan worden uitgevoerd zonder het gebruik van dure r…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door de NIH-1R15HL135675-01 tot en met Timothy J. LaRocca
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
Referenzen
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, a. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).
