Summary

Идентификация Роман CK2 киназы субстратов, используя универсальный подход биохимические

Published: February 21, 2019
doi:

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в этикетке, обогатить и идентифицировать субстратов протеинкиназы CK2 от сложный биологический образец например lysate клетки или ткани огневки. Этот метод использует уникальные аспекты CK2 биологии для этой цели.

Abstract

Изучение отношения киназы субстрат имеет важное значение для полного понимания функций этих ферментов и их вниз по течению целей в физиологических и патологических государствах. CK2 является эволюционно сохранены Серин/треонин киназу с растущим списком сотен субстратов, участвующих в нескольких клеточных процессах. Благодаря своим свойствам плейотропный выявления и классификации всеобъемлющий набор CK2 субстратов был особенно сложным и остается препятствием в изучении этой важной фермента. Для решения этой проблемы, мы разработали универсальный экспериментальной стратегии, которая позволяет целевых обогащения и идентификации предполагаемого CK2 субстратов. Этот протокол использует уникальный двойной Сопредседатель субстратная специфичность по CK2 позволяя для конкретных thiophosphorylation его субстратов в клетки или ткани lysate. Эти белки субстрата, впоследствии алкилированные, immunoprecipitated и выявленные жидкостной хроматографии/тандемные масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Ранее мы использовали этот подход успешно определить CK2 субстратов из яичников дрозофилы и здесь мы распространить применение настоящего протокола для клеток глиобластомы человека, иллюстрирующие адаптации этого метода для расследования биологической роли этой киназы в различных модельных организмов и экспериментальных систем.

Introduction

Протеинкиназы являются ключевыми компонентами трансдукции сигнала каскады. Фосфорилирование белков субстрата этими ферментами выпытывают биологических реакций, которые регулируют критические события контролируя деление клеток, обмен веществ и дифференциации, среди других. CK2 является повсеместно выражаются, ацидофильной Серин/треонин киназу, сохраняется из дрожжей для людей и который играет важную роль во многих клеточных процессах, начиная от регуляцию клеточного цикла прогрессии к апоптозу1 ,2,3. Фермент является heterotetramer, состоящий из двух каталитических α (или α’) субблоков и два регулирующих β субблоков4. В дополнение к весьма плейотропный, CK2 экспонатов два других необычные характеристики усложняют его анализа, а именно учредительные деятельности5 и двойной Сопредседатель субстрата специфика6. Это последний свойство наделяет CK2 с возможностью использования гтп, а также АТФ для фосфорилирование белков субстрата.

Генетическая удаление катализатора или регулирования подразделений CK2 мышей приводит к эмбриональной летальность, указав, что он играет решающую роль во время разработки и Органогенез7,8. CK2 также оверэкспрессировали в нескольких типов рака и таким образом представляет собой многообещающие терапевтические задачи9,10,11. Действительно специфичные ингибиторы что целевой CK2 киназы деятельность в настоящее время проводится расследование для этой цели по12,,1314. В то время как ингибирование CK2 является жизнеспособным вариантом, учитывая его плейотропный характер, альтернативу, и возможно более рациональный подход для критических подложек CK2, которые лежат в основе прогрессирования некоторых видов рака. Таким образом всеобъемлющее определение и характеристика CK2 субстрата белков бы значительные выгоды для выяснения конкретных функцией(ями) этой киназы в пределах определенного типа ткани или опухоли.

Здесь мы описываем универсальный биохимическим методом для выявления CK2 подложек из сложных биологических образцов такие клетки или ткани lysate. Этот протокол использует двойной Сопредседатель субстратная специфичность CK2 использованием GTP аналог GTPγS (гуанозина 5′-[γ-thio]triphosphate), что нельзя использовать другие эндогенные киназы. Это позволяет эффективно киназы «маркировать» его субстратов в этом образце для последующего изоляции и идентификации.

Protocol

Примечание: Убедитесь, что необходимые материалы доступны и должным образом подготовленных (см. Таблицу материалы). 1. Подготовка Механически лизируйте образцы тканей (1-2 мг ткани в 100 мкл буфера lysis, Таблица 1) или культивируемых клеток (плита 10 см, 80-9…

Representative Results

Схема экспериментальной процедуры представлена на рисунке 1. В основе техники лежит необычные способности CK2 использовать GTP для передачи группы фосфорила. Добавление внешних CK2 Холофермент наряду с GTP аналог, GTPγS, lysate клетки приводит к thiophosphorylation эндог?…

Discussion

Здесь мы описываем относительно простой биохимическим методом для выявления субстратов протеинкиназы CK2 от сложных биологических образцов. Важнейшие шаги настоящего Протокола основаны на необычные ферментативных свойств CK2 и включают CK2-зависимой thiophosphorylation конкретного субстрата бе…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа частично поддержали Содружества универсальный исследования повышение грант от Пенсильвании Департамента здравоохранения для T.I.S.

Materials

12 mg/mL PNBM Abcam ab138910 40.5 µL
2.5 mM GTPγS Sigma-Aldrich G8634-1MG 5.4 µL
Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-373894 1:1000 for Western blotting
Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-32233 1:1000 for Western blotting
Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody Abcam ab22758 1:1000 for Western blotting
Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody Abcam ab92570 Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
Centrifuge pre-set to 4ºC ThermoScientific Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 
cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor Roche 11836170001
Lysis Buffer See recipe below See recipe below 30 mL
Normal rabbit IgG antibody (isotype control) Cell Signaling Technology 2729S  Varies (final concentration 2.8 µg for each sample)
PD MiniTrap Column GE Healthcare 28-9180-10 3 columns
Protein A/G Plus Agarose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003 600 µL
Recombinant human CK2 holoenzyme New England Biolabs P6010S 2.7 µL
Rotator Labnet: Mini Labroller Mini Labroller SKU# H5500
T98G human glioblastoma cells ATCC CRL-1690
Water bath pre-set to 30ºC Shel Lab H20 Bath Series Model# SWB15

Referenzen

  1. Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
  2. Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
  3. Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
  4. Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
  5. Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
  6. Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
  7. Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
  8. Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
  9. Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
  10. Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
  11. Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
  12. Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Krebsforschung. 70 (24), 10288-10298 (2010).
  13. Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
  14. Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
  15. Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
  16. Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
  17. Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
  18. McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
  19. Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
  20. Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
  21. Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
  22. Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
  23. Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Chojnowski, J. E., McMillan, E. A., Strochlic, T. I. Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach. J. Vis. Exp. (144), e59037, doi:10.3791/59037 (2019).

View Video