Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer
Summary
Dieses Protokoll soll veranschaulichen, wie zu verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch im Herzen ändern können.
Abstract
Mitochondrien und oxidativen Stoffwechsel sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Funktion des Herzmuskels. Forschung hat gezeigt, dass mitochondriale Dysfunktion ein wichtiger Faktor für beeinträchtigte Herzfunktion bei Herzinsuffizienz gefunden. Im Gegensatz dazu möglicherweise Wiederherstellung defekter mitochondriale Funktion wohltuende Wirkung auf die Verbesserung der Herzfunktion bei Herzinsuffizienz. Daher könnte die regulatorischen Mechanismen und Identifizierung neuer Regler für mitochondriale Funktion Einblicke die genutzt werden könnten, um neue therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Hier ist kardialen Myozyten mitochondriale Atmung mit einer einzigartigen Zellkultursystem analysiert. Zunächst wurde ein Protokoll optimiert, um schnell zu isolieren und hohe Rentabilität Neugeborenen Maus Herzzellen Kultur. Dann ist eine 96-Well-Format extrazelluläre Flussmittel Analyzer verwendet, um den Sauerstoff-Verbrauch von diesen Kardiomyozyten zu beurteilen. Für dieses Protokoll wir säen Bedingungen optimiert und demonstrierte, dass Neugeborenen Maus Herzzellen Sauerstoff-Verbrauch leicht in eine extrazelluläre Flux-Analysator beurteilt werden kann. Wir beachten, dass unser Protokoll auf eine größere Größe der Kultur auch kann und andere Studien, wie z. B. die intrazelluläre Signal- und kontraktile Analyse Funktion.
Introduction
Um eine stetige kardiale kontraktile Funktion aufrecht zu erhalten, müssen die Herzzellen eine konstante Versorgung mit zellulären Energie hauptsächlich in Form von ATP1pflegen. Im Herzen entsteht etwa 95 % der ATP durch Mitochondrien, vor allem durch Oxidative Phosphorylierung, zeigt, dass Mitochondrien Herzfunktion2,3bioenergetische maßgeblich beteiligt. Unterstützen diese Vorstellung ist, dass Dysregulation der mitochondrialen Funktion zu Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz4,5führen kann. Umgekehrt, Wiederherstellung der Funktion der Mitochondrien hat gezeigt, dass das Versagen der Herzfunktion verbessern Herz-6,7. Daher konnte studieren des Mechanismus der mitochondrialen Bioenergetik und Identifizierung neuartige Regulatoren der mitochondrialen Funktion in Kardiomyozyten verraten nicht nur mechanistische Einblicke der kardialen Energieerzeugung aber auch Einblick, der führt zur Entwicklung neuer therapeutischer Ziele zur Behandlung von Herz-Kreislauferkrankungen6,8.
Im Vergleich zu das ganze Herz, die enthält einer Mischungaus von Myozyten und nicht Myozyten9, Cardiomyocyte Kulturen sind hochrein, mit minimalen Kontamination von nicht-Myozyten aus dem Herzen, wie z. B. Fibroblasten und Endothelzellen10. Darüber hinaus ermöglicht isolieren Herzzellen von neugeborenen Welpen züchten eine große Anzahl von Zellen in einer kleinen Menge der Zeit, im Vergleich zu isolierenden Zellen von Erwachsenen Herzen10,11. Vor allem primäre kultivierten erwachsenen Maus Herzzellen haben kurze überleben Zeiten (z.B. 24 h) und auf längere Zeit de-Punkte unterscheiden. Neugeborenen Maus Herzzellen können überleben und für mehr als 7 Tage in der Kultur, wodurch sie ideal für die Prüfung der Auswirkungen der Wirkstoffe und Genmanipulation auf die Funktion der Mitochondrien in Kardiomyozyten10manipuliert werden. Natürlich gibt es biologische Unterschiede zwischen den Erwachsenen und Neugeborenen Zellen, aber die längere Dauer, die für Kultur neonatale Zellen macht sie geeignet für viele verschiedene Arten von Studien, einschließlich der Funktion der Mitochondrien.
Bisher wurden primäre kultivierte Neugeborene Maus und Ratte Kardiomyozyten als Modelle zur kardialen Bioenergetik12,13zu studieren. In den letzten Jahren verwendet Studien einen extrazelluläre Flux-Analysator Sauerstoff-Verbrauch (OCR) messen und auswerten oxidative Kapazität bei Maus und Ratte neonatale Kardiomyozyten14,15. Während mit Ratten verglichen, die Zellviabilität des Neugeborenen Maus Herzzellen ist niedriger und hat größere Variabilität16. Außerdem macht die Fähigkeit, Zellen aus gentechnisch veränderter Mausmodelle im Mausmodell Zelle sehr wichtig. Da die OCR-Studien so empfindlich auf Zell-Zahl und Dichte Aussaat sind, braucht man Entwicklung eines reproduzierbaren, zuverlässig und einfach Protokolls, konsequente Zellausbeute und Rentabilität zu erzielen.
Hier berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das entwickelt worden ist die kultivierte Maus neonatale Herzzellen zusammen mit einem 96-Well-Format extrazelluläre Flux-Analysator für OCR-Analyse verwendet. Dieses Protokoll wird die Reproduzierbarkeit des Assays stark erhöht. Darüber hinaus das Protokoll nicht nur bietet eine neuartige und reproduzierbare Methode für OCR-Analyse, sondern könnte auch zu einer größeren Größe Kultur für andere experimentelle Zwecke, wie die möglicherweise notwendigen myofibrillären Funktionen zu studieren und intrazellulären angepasst werden Signalwege.
Dieses Protokoll beschreibt insbesondere eine eintägige Verfahren zur Isolierung und Kultur des Neugeborenen Maus Herzzellen in eine 96-Well Zellplatte Kultur. Darüber hinaus beschreibt es die Verfahren zur Messung der Sauerstoff-Verbrauch mit einem extrazellulären Flux-Analyzer. Alle Lösungen sind steril oder steril filtriert. Alle Werkzeuge werden mit 75 % igem Ethanol sterilisiert. Wir bieten eine Tabelle von Materialien für verschiedene Teile des Verfahrens. Für die Kultivierung von Kardiomyozyten, erfolgen alle Abläufe und Schritte in eine Standardzelle Kultur Kapuze. Dieses Protokoll ist für die Isolierung von Neugeborenen Mäuseherzen aus einem Wurf (ca. 8-10 Welpen) entwickelt. Das Protokoll kann jedoch auch zur Isolierung von Herzzellen aus mehreren Würfen angepasst.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Kultivierung Maus neonatale Kardiomyozyten etabliert. Durch die Verwendung dieser Kardiomyozyten, haben wir auch die Voraussetzungen für die Sauerstoff-Verbrauch messen mit einem extrazellulären Flussmittel Analyzer System optimiert. Das Protokoll erlaubt verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch in den wichtigsten arbeitenden Zellen des Herzens, vergleichbar mit, wa…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten alle Ross Lab und Murphy Lab Mitgliedern danken. Diese Arbeit wird unterstützt durch die American Heart Association (14SDG17790005), Y.C NIH (HL115933, HL127806) und VA Verdienst (BX003260), R.S.R.
Materials
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
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